Terima kasih telah mengunjungi nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan menggunakan versi peramban terbaru (atau menonaktifkan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, situs ini akan bebas dari gaya dan JavaScript.
Otot rangka adalah jaringan heterogen yang sebagian besar terdiri dari miofibril, yang pada manusia biasanya diklasifikasikan menjadi tiga jenis: satu "lambat" (tipe 1) dan dua "cepat" (tipe 2A dan 2X). Namun, heterogenitas antara dan di dalam jenis miofibril tradisional masih kurang dipahami. Kami menerapkan pendekatan transkriptomik dan proteomik pada 1050 dan 1038 miofibril individu dari vastus lateralis manusia, masing-masing. Studi proteomik mencakup pria, dan studi transkriptomik mencakup 10 pria dan 2 wanita. Selain isoform rantai berat miosin, kami mengidentifikasi protein metabolik, protein ribosom, dan protein persimpangan seluler sebagai sumber variabilitas intermiofibril multidimensional. Lebih lanjut, meskipun identifikasi kelompok serat lambat dan cepat, data kami menunjukkan bahwa serat tipe 2X secara fenotipik tidak dapat dibedakan dari serat kontraksi cepat lainnya. Selain itu, klasifikasi berdasarkan rantai berat miosin tidak cukup untuk menggambarkan fenotipe miofiber pada miopati nemaline. Secara keseluruhan, data kami menunjukkan heterogenitas miofiber multidimensi, dengan sumber variasi yang meluas melampaui isoform rantai berat miosin.
Heterogenitas seluler merupakan ciri inheren dari semua sistem biologis, yang memungkinkan sel untuk berspesialisasi guna memenuhi kebutuhan jaringan dan sel yang berbeda.1 Pandangan tradisional tentang heterogenitas serat otot rangka adalah bahwa neuron motorik menentukan tipe serat dalam unit motorik, dan tipe serat (yaitu, tipe 1, tipe 2A, dan tipe 2X pada manusia) ditentukan oleh karakteristik isoform rantai berat miosin (MYH).2 Hal ini awalnya didasarkan pada ketidakstabilan pH ATPase mereka,3,4 dan kemudian pada ekspresi molekuler MYH mereka.5 Namun, dengan identifikasi dan penerimaan selanjutnya dari serat "campuran" yang mengekspresikan beberapa MYH dalam proporsi yang bervariasi, serat otot rangka semakin dipandang sebagai suatu kontinum daripada sebagai tipe serat yang berbeda.6 Meskipun demikian, bidang ini masih sangat bergantung pada MYH sebagai pengklasifikasi utama untuk klasifikasi miofiber, pandangan yang kemungkinan dipengaruhi oleh keterbatasan dan bias signifikan dari studi awal pada hewan pengerat yang profil ekspresi MYH dan rentang tipe seratnya berbeda dari yang ada pada manusia.2 Situasinya adalah Hal ini semakin diperumit oleh fakta bahwa otot rangka manusia yang berbeda menunjukkan beragam jenis serat.7 Otot vastus lateralis adalah otot campuran dengan profil ekspresi MYH menengah (dan karenanya representatif).7 Selain itu, kemudahan pengambilan sampelnya menjadikannya otot yang paling banyak dipelajari pada manusia.
Oleh karena itu, investigasi yang tidak bias terhadap keragaman serat otot rangka menggunakan alat "omics" yang canggih sangat penting tetapi juga menantang, sebagian karena sifat multinukleat dari serat otot rangka. Namun, teknologi transkriptomik8,9 dan proteomik10 telah mengalami revolusi dalam sensitivitas dalam beberapa tahun terakhir karena berbagai kemajuan teknologi, memungkinkan analisis otot rangka pada resolusi serat tunggal. Akibatnya, kemajuan signifikan telah dicapai dalam mengkarakterisasi keragaman serat tunggal dan responsnya terhadap rangsangan atrofi dan penuaan11,12,13,14,15,16,17,18. Yang penting, kemajuan teknologi ini memiliki aplikasi klinis, memungkinkan karakterisasi yang lebih rinci dan tepat dari disregulasi yang terkait dengan penyakit. Sebagai contoh, patofisiologi miopati nemaline, salah satu penyakit otot bawaan yang paling umum (MIM 605355 dan MIM 161800), kompleks dan membingungkan.19,20 Oleh karena itu, karakterisasi yang lebih baik tentang disregulasi serat otot rangka dapat menghasilkan kemajuan signifikan dalam pemahaman kita tentang penyakit ini.
Kami mengembangkan metode untuk analisis transkriptomik dan proteomik serat otot rangka tunggal yang diisolasi secara manual dari spesimen biopsi manusia dan menerapkannya pada ribuan serat, memungkinkan kami untuk menyelidiki heterogenitas seluler serat otot rangka manusia. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan kekuatan fenotipe transkriptomik dan proteomik serat otot dan mengidentifikasi protein metabolik, ribosom, dan persimpangan seluler sebagai sumber signifikan variabilitas antar serat. Lebih lanjut, menggunakan alur kerja proteomik ini, kami mengkarakterisasi relevansi klinis miopati nematoda pada serat otot rangka tunggal, mengungkapkan pergeseran terkoordinasi menuju serat non-oksidatif yang independen dari jenis serat berdasarkan MYH.
Untuk menyelidiki heterogenitas serat otot rangka manusia, kami mengembangkan dua alur kerja untuk memungkinkan analisis transkriptom dan proteom dari serat otot rangka tunggal (Gambar 1A dan Gambar Tambahan 1A). Kami mengembangkan dan mengoptimalkan beberapa langkah metodologis, mulai dari penyimpanan sampel dan pelestarian integritas RNA dan protein hingga pengoptimalan throughput untuk setiap pendekatan. Untuk analisis transkriptom, ini dicapai dengan memasukkan barcode molekuler spesifik sampel pada langkah awal transkripsi balik, memungkinkan 96 serat dikumpulkan untuk pemrosesan hilir yang efisien. Pengurutan yang lebih dalam (±1 juta pembacaan per serat) dibandingkan dengan pendekatan sel tunggal tradisional lebih memperkaya data transkriptom. 21 Untuk proteomik, kami menggunakan gradien kromatografi pendek (21 menit) yang dikombinasikan dengan akuisisi data DIA-PASEF pada spektrometer massa timsTOF untuk mengoptimalkan kedalaman proteom sambil mempertahankan throughput tinggi. 22,23 Untuk menyelidiki heterogenitas serat otot rangka yang sehat, kami mengkarakterisasi transkriptom dari 1.050 serat individu dari 14 donor dewasa sehat dan proteom dari 1.038 serat dari 5 donor dewasa sehat (Tabel Tambahan 1). Dalam makalah ini, kumpulan data ini masing-masing disebut sebagai transkriptom dan proteom 1.000 serat. Pendekatan kami mendeteksi total 27.237 transkrip dan 2.983 protein dalam analisis transkriptomik dan proteomik 1.000 serat (Gambar 1A, Kumpulan Data Tambahan 1–2). Setelah menyaring kumpulan data transkriptomik dan proteomik untuk >1.000 gen yang terdeteksi dan 50% nilai valid per serat, analisis bioinformatika selanjutnya dilakukan untuk 925 dan 974 serat dalam transkriptom dan proteom, masing-masing. Setelah penyaringan, rata-rata 4257 ± 1557 gen dan 2015 ± 234 protein (rata-rata ± SD) terdeteksi per serat, dengan variabilitas antar individu yang terbatas (Gambar Tambahan 1B–C, Kumpulan Data Tambahan 3–4). Namun, variabilitas dalam subjek lebih menonjol di antara peserta, kemungkinan karena perbedaan hasil RNA/protein antara serat dengan panjang dan luas penampang yang berbeda. Untuk sebagian besar protein (>2000), koefisien variasi berada di bawah 20% (Gambar Tambahan 1D). Kedua metode tersebut memungkinkan untuk menangkap rentang dinamis transkrip dan protein yang luas dengan tanda ekspresi tinggi yang penting untuk kontraksi otot (misalnya, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Gambar Tambahan 1E–F). Sebagian besar fitur yang teridentifikasi sama antara dataset transkriptomik dan proteomik (Gambar Tambahan 1G), dan intensitas UMI/LFQ rata-rata dari fitur-fitur ini berkorelasi cukup baik (r = 0,52) (Gambar Tambahan 1H).
Alur kerja transkriptomik dan proteomik (dibuat dengan BioRender.com). BD Kurva rentang dinamis untuk MYH7, MYH2, dan MYH1, dan ambang batas yang dihitung untuk penugasan tipe serat. E, F Distribusi ekspresi MYH di seluruh serat dalam dataset transkriptomik dan proteomik. G, H Plot Pendekatan dan Proyeksi Keragaman Seragam (UMAP) untuk transkriptomik dan proteomik yang diwarnai berdasarkan tipe serat berbasis MYH. I, J Plot fitur yang menunjukkan ekspresi MYH7, MYH2, dan MYH1 dalam dataset transkriptomik dan proteomik.
Awalnya, kami berupaya menetapkan tipe serat berbasis MYH untuk setiap serat menggunakan pendekatan yang dioptimalkan yang memanfaatkan sensitivitas tinggi dan rentang dinamis ekspresi MYH dalam dataset omics. Studi sebelumnya telah menggunakan ambang batas arbitrer untuk memberi label serat sebagai tipe 1 murni, tipe 2A, tipe 2X, atau campuran berdasarkan persentase ekspresi tetap dari MYH yang berbeda11,14,24. Kami menggunakan pendekatan yang berbeda di mana ekspresi setiap serat diberi peringkat berdasarkan MYH yang kami gunakan untuk menentukan tipe serat: MYH7, MYH2, dan MYH1, yang masing-masing sesuai dengan serat tipe 1, tipe 2A, dan tipe 2X. Kemudian, kami menghitung secara matematis titik infleksi bawah dari setiap kurva yang dihasilkan dan menggunakannya sebagai ambang batas untuk menetapkan serat sebagai positif (di atas ambang batas) atau negatif (di bawah ambang batas) untuk setiap MYH (Gambar 1B–D). Data ini menunjukkan bahwa MYH7 (Gambar 1B) dan MYH2 (Gambar 1C) memiliki profil ekspresi on/off yang lebih berbeda pada tingkat RNA dibandingkan dengan tingkat protein. Memang, pada tingkat protein, sangat sedikit serat yang tidak mengekspresikan MYH7, dan tidak ada serat yang memiliki ekspresi MYH2 100%. Selanjutnya, kami menggunakan ambang batas ekspresi yang telah ditentukan untuk menetapkan tipe serat berbasis MYH ke semua serat dalam setiap dataset. Misalnya, serat MYH7+/MYH2-/MYH1- ditetapkan ke tipe 1, sedangkan serat MYH7-/MYH2+/MYH1+ ditetapkan ke tipe campuran 2A/2X (lihat Tabel Tambahan 2 untuk deskripsi lengkap). Dengan menggabungkan semua serat, kami mengamati distribusi tipe serat berbasis MYH yang sangat mirip baik pada tingkat RNA (Gambar 1E) maupun protein (Gambar 1F), sementara komposisi relatif tipe serat berbasis MYH bervariasi antar individu, seperti yang diharapkan (Gambar Tambahan 2A). Sebagian besar serat diklasifikasikan sebagai tipe 1 murni (34–35%) atau tipe 2A (36–38%), meskipun sejumlah besar serat campuran tipe 2A/2X juga terdeteksi (16–19%). Perbedaan yang mencolok adalah bahwa serat tipe 2X murni hanya dapat dideteksi pada tingkat RNA, tetapi tidak pada tingkat protein, menunjukkan bahwa ekspresi MYH yang cepat setidaknya sebagian diatur secara pasca-transkripsi.
Kami memvalidasi metode penentuan tipe serat MYH berbasis proteomik kami menggunakan dot blotting berbasis antibodi, dan kedua metode tersebut mencapai kesepakatan 100% dalam mengidentifikasi serat tipe 1 dan tipe 2A murni (lihat Gambar Tambahan 2B). Namun, pendekatan berbasis proteomik lebih sensitif, lebih efisien dalam mengidentifikasi serat campuran, dan mengukur proporsi setiap gen MYH di setiap serat. Data ini menunjukkan efektivitas penggunaan pendekatan berbasis omik yang objektif dan sangat sensitif untuk mengkarakterisasi tipe serat otot rangka.
Kemudian, kami menggunakan informasi gabungan yang diberikan oleh transkriptomik dan proteomik untuk mengklasifikasikan serat otot secara objektif berdasarkan transkriptom atau proteom lengkapnya. Dengan menggunakan metode pendekatan dan proyeksi manifold seragam (UMAP) untuk mengurangi dimensi menjadi enam komponen utama (Gambar Tambahan 3A–B), kami dapat memvisualisasikan variabilitas serat otot dalam transkriptom (Gambar 1G) dan proteom (Gambar 1H). Perlu dicatat, serat otot tidak dikelompokkan berdasarkan peserta (Gambar Tambahan 3C–D) atau hari pengujian (Gambar Tambahan 3E) baik dalam dataset transkriptomik maupun proteomik, yang menunjukkan bahwa variabilitas dalam subjek pada serat otot rangka lebih tinggi daripada variabilitas antar subjek. Dalam plot UMAP, muncul dua kelompok berbeda yang mewakili serat otot "cepat" dan "lambat" (Gambar 1G–H). Serat otot MYH7+ (lambat) terkumpul di kutub positif UMAP1, sedangkan serat otot MYH2+ dan MYH1+ (cepat) terkumpul di kutub negatif UMAP1 (Gambar 1I–J). Namun, tidak ada perbedaan yang dibuat antara tipe serat otot cepat (yaitu, tipe 2A, tipe 2X, atau campuran 2A/2X) berdasarkan ekspresi MYH, menunjukkan bahwa ekspresi MYH1 (Gambar 1I–J) atau penanda serat otot 2X klasik lainnya seperti ACTN3 atau MYLK2 (Gambar Tambahan 4A–B) tidak membedakan antara berbagai tipe serat otot jika mempertimbangkan keseluruhan transkriptom atau proteom. Selain itu, dibandingkan dengan MYH2 dan MYH7, hanya sedikit transkrip atau protein yang berkorelasi positif dengan MYH1 (Gambar Tambahan 4C–H), menunjukkan bahwa kelimpahan MYH1 tidak sepenuhnya mencerminkan transkriptom/proteom serat otot. Kesimpulan serupa diperoleh ketika menilai ekspresi campuran dari tiga isoform MYH pada tingkat UMAP (Gambar Tambahan 4I–J). Dengan demikian, sementara serat 2X dapat diidentifikasi pada tingkat transkrip berdasarkan kuantifikasi MYH saja, serat MYH1+ tidak dapat dibedakan dari serat cepat lainnya jika mempertimbangkan keseluruhan transkriptom atau proteom.
Sebagai eksplorasi awal heterogenitas serat lambat di luar MYH, kami menilai empat protein spesifik tipe serat lambat yang telah ditetapkan: TPM3, TNNT1, MYL3, dan ATP2A22. Subtipe serat lambat menunjukkan korelasi Pearson yang tinggi, meskipun tidak sempurna, dengan MYH7 baik dalam transkriptomik (Gambar Tambahan 5A) maupun proteomik (Gambar Tambahan 5B). Sekitar 25% dan 33% serat lambat tidak diklasifikasikan sebagai serat lambat murni oleh semua subtipe gen/protein dalam transkriptomik (Gambar Tambahan 5C) dan proteomik (Gambar Tambahan 5D), masing-masing. Oleh karena itu, klasifikasi serat lambat berdasarkan beberapa subtipe gen/protein memperkenalkan kompleksitas tambahan, bahkan untuk protein yang diketahui spesifik tipe serat. Hal ini menunjukkan bahwa klasifikasi serat berdasarkan isoform dari satu famili gen/protein mungkin tidak cukup mencerminkan heterogenitas sebenarnya dari serat otot rangka.
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut variabilitas fenotipik serat otot rangka manusia pada skala keseluruhan model omik, kami melakukan pengurangan dimensi data yang tidak bias menggunakan analisis komponen utama (PCA) (Gambar 2A). Mirip dengan plot UMAP, baik partisipan maupun hari pengujian tidak memengaruhi pengelompokan serat pada tingkat PCA (Gambar Tambahan 6A–C). Pada kedua dataset, tipe serat berbasis MYH dijelaskan oleh PC2, yang menunjukkan kelompok serat tipe 1 berkedut lambat dan kelompok kedua yang berisi serat tipe 2A berkedut cepat, tipe 2X, dan campuran 2A/2X (Gambar 2A). Pada kedua dataset, kedua kelompok ini dihubungkan oleh sejumlah kecil serat tipe 1/2A campuran. Seperti yang diharapkan, analisis overrepresentasi dari penggerak PC utama mengkonfirmasi bahwa PC2 didorong oleh tanda tangan kontraktil dan metabolik (Gambar 2B dan Gambar Tambahan 6D–E, Dataset Tambahan 5–6). Secara keseluruhan, tipe serat berbasis MYH terbukti cukup untuk menjelaskan variasi kontinu di sepanjang PC2, kecuali untuk serat yang disebut 2X yang tersebar di seluruh transkriptom dalam kluster cepat.
A. Plot analisis komponen utama (PCA) dari dataset transkriptom dan proteom yang diwarnai menurut tipe serat berdasarkan MYH. B. Analisis pengayaan penggerak transkrip dan protein di PC2 dan PC1. Analisis statistik dilakukan menggunakan paket clusterProfiler dan nilai p yang disesuaikan Benjamini-Hochberg. C, D. Plot PCA yang diwarnai menurut istilah ontologi gen adhesi intraseluler (GO) dalam transkriptom dan istilah GO kostamer dalam proteom. Panah menunjukkan penggerak transkrip dan protein serta arahnya. E, F. Plot fitur perkiraan dan proyeksi manifold seragam (UMAP) dari fitur yang relevan secara klinis yang menunjukkan gradien ekspresi yang independen dari tipe serat lambat/cepat. G, H. Korelasi antara penggerak PC2 dan PC1 dalam transkriptom dan proteom.
Secara tak terduga, tipe miofiber berbasis MYH hanya menjelaskan tingkat variabilitas tertinggi kedua (PC2), menunjukkan bahwa faktor biologis lain yang tidak terkait dengan tipe miofiber berbasis MYH (PC1) memainkan peran penting dalam mengatur heterogenitas serat otot rangka. Analisis overrepresentasi dari penggerak utama dalam PC1 mengungkapkan bahwa variabilitas dalam PC1 terutama ditentukan oleh adhesi sel-ke-sel dan kandungan ribosom dalam transkriptom, serta kostamer dan protein ribosom dalam proteom (Gambar 2B dan Gambar Tambahan 6D–E, Kumpulan Data Tambahan 7). Pada otot rangka, kostamer menghubungkan cakram Z ke sarkolema dan terlibat dalam transmisi gaya dan pensinyalan. 25 Plot PCA yang dianotasi menggunakan fitur adhesi sel-ke-sel (transkriptom, Gambar 2C) dan kostamer (proteom, Gambar 2D) mengungkapkan pergeseran kiri yang kuat pada PC1, menunjukkan bahwa fitur-fitur ini diperkaya dalam serat tertentu.
Pemeriksaan yang lebih detail terhadap pengelompokan miofiber pada tingkat UMAP mengungkapkan bahwa sebagian besar fitur menunjukkan gradien ekspresi berbasis MYH yang tidak bergantung pada tipe miofiber, bukan spesifik subkelompok miofiber. Kontinuitas ini diamati untuk beberapa gen yang terkait dengan kondisi patologis (Gambar 2E), seperti CHCHD10 (penyakit neuromuskular), SLIT3 (atrofi otot), CTDNEP1 (penyakit otot). Kontinuitas ini juga diamati di seluruh proteom, termasuk protein yang terkait dengan gangguan neurologis (UGDH), pensinyalan insulin (PHIP), dan transkripsi (HIST1H2AB) (Gambar 2F). Secara kolektif, data ini menunjukkan kontinuitas dalam heterogenitas kontraksi lambat/cepat yang tidak bergantung pada tipe serat di berbagai miofiber.
Menariknya, gen penggerak pada PC2 menunjukkan korelasi transkriptom-proteom yang baik (r = 0,663) (Gambar 2G), menunjukkan bahwa tipe serat otot lambat dan cepat, dan khususnya sifat kontraktil dan metabolik serat otot rangka, diatur secara transkripsional. Namun, gen penggerak pada PC1 tidak menunjukkan korelasi transkriptom-proteom (r = -0,027) (Gambar 2H), menunjukkan bahwa variasi yang tidak terkait dengan tipe serat otot lambat/cepat sebagian besar diatur secara pasca-transkripsional. Karena variasi pada PC1 terutama dijelaskan oleh istilah ontologi gen ribosom, dan mengingat bahwa ribosom memainkan peran penting dan khusus dalam sel dengan secara aktif berpartisipasi dan memengaruhi translasi protein,31 selanjutnya kami berupaya untuk menyelidiki heterogenitas ribosom yang tidak terduga ini.
Pertama, kami mewarnai plot analisis komponen utama proteomik sesuai dengan kelimpahan relatif protein dalam istilah GOCC "ribosom sitoplasma" (Gambar 3A). Meskipun istilah ini diperkaya di sisi positif PC1, menghasilkan gradien kecil, protein ribosom mendorong partisi ke kedua arah PC1 (Gambar 3A). Protein ribosom yang diperkaya di sisi negatif PC1 termasuk RPL18, RPS18, dan RPS13 (Gambar 3B), sedangkan RPL31, RPL35, dan RPL38 (Gambar 3C) adalah pendorong utama di sisi positif PC1. Menariknya, RPL38 dan RPS13 diekspresikan secara tinggi di otot rangka dibandingkan dengan jaringan lain (Gambar Tambahan 7A). Tanda tangan ribosom yang khas ini di PC1 tidak diamati dalam transkriptom (Gambar Tambahan 7B), menunjukkan regulasi pasca-transkripsi.
A. Plot analisis komponen utama (PCA) yang diwarnai sesuai dengan istilah ontologi gen (GO) ribosom sitoplasma di seluruh proteom. Panah menunjukkan arah variasi yang dimediasi protein dalam plot PCA. Panjang garis sesuai dengan skor komponen utama untuk protein tertentu. B, C. Plot fitur PCA untuk RPS13 dan RPL38. D. Analisis pengelompokan hierarkis tanpa pengawasan dari protein ribosom sitoplasma. E. Model struktural ribosom 80S (PDB: 4V6X) yang menyoroti protein ribosom dengan kelimpahan berbeda dalam serat otot rangka. F. Protein ribosom dengan stoikiometri berbeda yang terlokalisasi di dekat saluran keluar mRNA.
Konsep heterogenitas dan spesialisasi ribosom telah diajukan sebelumnya, di mana keberadaan subpopulasi ribosom yang berbeda (heterogenitas ribosom) dapat secara langsung memengaruhi translasi protein di berbagai jaringan32 dan sel33 melalui translasi selektif dari kumpulan transkrip mRNA spesifik34 (spesialisasi ribosom). Untuk mengidentifikasi subpopulasi protein ribosom yang diekspresikan bersama dalam serat otot rangka, kami melakukan analisis pengelompokan hierarkis tanpa pengawasan terhadap protein ribosom dalam proteom (Gambar 3D, Kumpulan Data Tambahan 8). Seperti yang diharapkan, protein ribosom tidak mengelompok berdasarkan jenis serat berdasarkan MYH. Namun, kami mengidentifikasi tiga kelompok protein ribosom yang berbeda; kelompok pertama (ribosomal_cluster_1) diatur bersama dengan RPL38 dan karenanya memiliki peningkatan ekspresi pada serat dengan profil PC1 positif. Kelompok kedua (ribosomal_cluster_2) diatur bersama dengan RPS13 dan meningkat pada serat dengan profil PC1 negatif. Klaster ketiga (ribosomal_cluster_3) tidak menunjukkan ekspresi diferensial terkoordinasi pada serat otot rangka dan dapat dianggap sebagai protein ribosomal otot rangka "inti". Baik klaster ribosomal 1 dan 2 mengandung protein ribosomal yang sebelumnya telah terbukti mengatur translasi alternatif (misalnya, RPL10A, RPL38, RPS19, dan RPS25) dan secara fungsional memengaruhi perkembangan (misalnya, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Konsisten dengan hasil PCA, representasi heterogen yang diamati dari protein ribosomal ini di seluruh serat juga menunjukkan kontinuitas (Gambar Tambahan 7C).
Untuk memvisualisasikan lokasi protein ribosom heterogen di dalam ribosom, kami menggunakan model struktural ribosom 80S manusia (Bank Data Protein: 4V6X) (Gambar 3E). Setelah mengisolasi protein ribosom yang termasuk dalam kluster ribosom yang berbeda, lokasinya tidak selaras, menunjukkan bahwa pendekatan kami gagal memberikan pengayaan untuk wilayah/fraksi ribosom tertentu. Namun, yang menarik, proporsi protein subunit besar dalam kluster 2 lebih rendah daripada dalam kluster 1 dan 3 (Gambar Tambahan 7D). Kami mengamati bahwa protein dengan stoikiometri yang berubah dalam serat otot rangka sebagian besar terlokalisasi di permukaan ribosom (Gambar 3E), konsisten dengan kemampuannya untuk berinteraksi dengan elemen situs masuk ribosom internal (IRES) dalam populasi mRNA yang berbeda, sehingga mengoordinasikan translasi selektif. 40, 41 Lebih lanjut, banyak protein dengan stoikiometri yang berubah pada serat otot rangka terletak di dekat daerah fungsional seperti terowongan keluar mRNA (Gambar 3F), yang secara selektif mengatur pemanjangan translasi dan penghentian peptida tertentu. 42 Singkatnya, data kami menunjukkan bahwa stoikiometri protein ribosom otot rangka menunjukkan heterogenitas, yang mengakibatkan perbedaan antar serat otot rangka.
Selanjutnya, kami berupaya mengidentifikasi ciri khas serat otot cepat dan lambat serta mengeksplorasi mekanisme regulasi transkripsionalnya. Dengan membandingkan kelompok serat otot cepat dan lambat yang didefinisikan oleh UMAP dalam dua dataset (Gambar 1G–H dan 4A–B), analisis transkriptomik dan proteomik mengidentifikasi masing-masing 1366 dan 804 fitur yang berbeda kelimpahannya (Gambar 4A–B, Dataset Tambahan 9–12). Kami mengamati perbedaan yang diharapkan dalam ciri khas yang terkait dengan sarkomer (misalnya, tropomiosin dan troponin), kopling eksitasi-kontraksi (isoform SERCA), dan metabolisme energi (misalnya, ALDOA dan CKB). Selain itu, transkrip dan protein yang mengatur ubikuitinasi protein diekspresikan secara berbeda pada serat otot cepat dan lambat (misalnya, USP54, SH3RF2, USP28, dan USP48) (Gambar 4A–B). Selain itu, gen protein mikroba RP11-451G4.2 (DWORF), yang sebelumnya telah terbukti diekspresikan secara berbeda di berbagai jenis serat otot domba43 dan meningkatkan aktivitas SERCA di otot jantung44, secara signifikan meningkat pada serat otot rangka lambat (Gambar 4A). Demikian pula, pada tingkat serat individu, perbedaan signifikan diamati pada tanda-tanda yang diketahui seperti isoform laktat dehidrogenase terkait metabolisme (LDHA dan LDHB, Gambar 4C dan Gambar Tambahan 8A)45,46 serta tanda-tanda spesifik jenis serat yang sebelumnya tidak diketahui (seperti IRX3, USP54, USP28, dan DPYSL3) (Gambar 4C). Terdapat tumpang tindih yang signifikan dari fitur yang diekspresikan secara berbeda antara dataset transkriptomik dan proteomik (Gambar Tambahan 8B), serta korelasi perubahan lipatan yang didorong terutama oleh ekspresi diferensial yang lebih jelas dari fitur sarkomer (Gambar Tambahan 8C). Khususnya, beberapa penanda (misalnya USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) menunjukkan regulasi pasca-transkripsi yang kuat hanya pada tingkat proteomik dan memiliki profil ekspresi spesifik tipe serat otot lambat/cepat (Gambar Tambahan 8C).
A dan B Plot gunung berapi yang membandingkan kluster lambat dan cepat yang diidentifikasi oleh plot pendekatan dan proyeksi manifold seragam (UMAP) pada Gambar 1G–H. Titik berwarna mewakili transkrip atau protein yang berbeda secara signifikan pada FDR < 0,05, dan titik yang lebih gelap mewakili transkrip atau protein yang berbeda secara signifikan pada perubahan log > 1. Analisis statistik dua arah dilakukan menggunakan uji Wald DESeq2 dengan nilai p yang disesuaikan Benjamini–Hochberg (transkriptomik) atau metode model linier Limma dengan analisis Bayesian empiris diikuti oleh penyesuaian Benjamini–Hochberg untuk perbandingan berganda (proteomik). C Plot tanda tangan dari gen atau protein yang diekspresikan secara berbeda antara serat lambat dan cepat. D Analisis pengayaan transkrip dan protein yang diekspresikan secara berbeda secara signifikan. Nilai yang tumpang tindih diperkaya di kedua dataset, nilai transkriptom diperkaya hanya di transkriptom, dan nilai proteom diperkaya hanya di proteom. Analisis statistik dilakukan menggunakan paket clusterProfiler dengan nilai p yang disesuaikan Benjamini-Hochberg. E. Faktor transkripsi spesifik tipe serat yang diidentifikasi oleh SCENIC berdasarkan skor spesifisitas regulator yang diperoleh dari SCENIC dan ekspresi mRNA diferensial antara tipe serat. F. Pemprofilan faktor transkripsi terpilih yang diekspresikan secara diferensial antara serat lambat dan cepat.
Kemudian kami melakukan analisis overrepresentasi gen dan protein yang terwakili secara berbeda (Gambar 4D, Kumpulan Data Tambahan 13). Pengayaan jalur untuk fitur yang berbeda antara kedua kumpulan data mengungkapkan perbedaan yang diharapkan, seperti proses β-oksidasi asam lemak dan metabolisme keton (serat lambat), kontraksi miofilamen/otot (serat cepat dan lambat, masing-masing), dan proses katabolisme karbohidrat (serat cepat). Aktivitas protein fosfatase serin/treonin juga meningkat pada serat cepat, didorong oleh fitur-fitur seperti subunit fosfatase pengatur dan katalitik (PPP3CB, PPP1R3D, dan PPP1R3A), yang diketahui mengatur metabolisme glikogen (47) (Gambar Tambahan 8D–E). Jalur lain yang diperkaya dalam serat cepat termasuk badan pemrosesan (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) dalam proteom (Gambar Tambahan 8F), yang berpotensi terlibat dalam regulasi pasca-transkripsi (48), dan aktivitas faktor transkripsi (SREBF1, RXRG, RORA) dalam transkriptom (Gambar Tambahan 8G). Serat lambat diperkaya dalam aktivitas oksidoreduktase (BDH1, DCXR, TXN2) (Gambar Tambahan 8H), pengikatan amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Gambar Tambahan 8I), matriks ekstraseluler (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Gambar Tambahan 8J), dan aktivitas reseptor-ligan (FNDC5, SPX, NENF) (Gambar Tambahan 8K).
Untuk mendapatkan wawasan lebih lanjut mengenai regulasi transkripsi yang mendasari karakteristik tipe serat otot lambat/cepat, kami melakukan analisis pengayaan faktor transkripsi menggunakan SCENIC49 (Kumpulan Data Tambahan 14). Banyak faktor transkripsi yang diperkaya secara signifikan antara serat otot cepat dan lambat (Gambar 4E). Ini termasuk faktor transkripsi seperti MAFA, yang sebelumnya telah dikaitkan dengan perkembangan serat otot cepat,50 serta beberapa faktor transkripsi yang sebelumnya tidak terkait dengan program gen spesifik tipe serat otot. Di antara faktor-faktor ini, PITX1, EGR1, dan MYF6 adalah faktor transkripsi yang paling diperkaya dalam serat otot cepat (Gambar 4E). Sebaliknya, ZSCAN30 dan EPAS1 (juga dikenal sebagai HIF2A) adalah faktor transkripsi yang paling diperkaya dalam serat otot lambat (Gambar 4E). Konsisten dengan hal ini, MAFA diekspresikan pada tingkat yang lebih tinggi di wilayah UMAP yang sesuai dengan serat otot cepat, sementara EPAS1 memiliki pola ekspresi yang berlawanan (Gambar 4F).
Selain gen pengkode protein yang sudah dikenal, terdapat banyak biotipe RNA non-pengkode yang mungkin terlibat dalam regulasi perkembangan dan penyakit manusia. 51, 52 Dalam kumpulan data transkriptom, beberapa RNA non-pengkode menunjukkan spesifisitas tipe serat (Gambar 5A dan Kumpulan Data Tambahan 15), termasuk LINC01405, yang sangat spesifik untuk serat lambat dan dilaporkan menurun pada otot pasien dengan miopati mitokondrial. 53 Sebaliknya, RP11-255P5.3, yang sesuai dengan gen lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, menunjukkan spesifisitas tipe serat cepat. Baik LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) dan RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) menunjukkan spesifisitas otot rangka (Gambar Tambahan 9A–B) dan tidak memiliki gen kontraktil yang diketahui dalam lingkungan genomik 1 Mb mereka, menunjukkan bahwa mereka memainkan peran khusus dalam mengatur jenis serat daripada mengatur gen kontraktil tetangga. Profil ekspresi spesifik jenis serat lambat/cepat dari LINC01405 dan RP11-255P5.3, masing-masing, dikonfirmasi menggunakan RNAscope (Gambar 5B–C).
A. Transkrip RNA non-coding diatur secara signifikan pada serat otot tipe lambat dan cepat. B. Gambar RNAscope representatif yang menunjukkan spesifisitas tipe serat otot tipe lambat dan cepat dari LINC01405 dan RP11-255P5.3, masing-masing. Skala bar = 50 μm. C. Kuantifikasi ekspresi RNA non-coding spesifik tipe miofiber seperti yang ditentukan oleh RNAscope (n = 3 biopsi dari individu independen, membandingkan serat otot cepat dan lambat dalam setiap individu). Analisis statistik dilakukan menggunakan uji t Student dua arah. Plot kotak menunjukkan median dan kuartil pertama dan ketiga, dengan garis vertikal menunjuk ke nilai minimum dan maksimum. D. Alur kerja identifikasi protein mikroba de novo (dibuat dengan BioRender.com). E. Protein mikroba LINC01405_ORF408:17441:17358 secara spesifik diekspresikan dalam serat otot rangka lambat (n=5 biopsi dari peserta independen, membandingkan serat otot cepat dan lambat pada setiap peserta). Analisis statistik dilakukan menggunakan metode model linier Limm yang dikombinasikan dengan pendekatan Bayesian empiris, diikuti oleh metode Benjamini-Hochberg untuk perbandingan berganda dengan penyesuaian nilai p. Plot kotak menunjukkan median, kuartil pertama dan ketiga, dengan garis vertikal menunjuk ke nilai maksimum/minimum.
Baru-baru ini, penelitian menunjukkan bahwa banyak transkrip non-coding yang diduga mengkode protein mikroba yang ditranskripsikan, beberapa di antaranya mengatur fungsi otot. 44, 55 Untuk mengidentifikasi protein mikroba dengan spesifisitas tipe serat potensial, kami mencari dataset proteom 1000 serat kami menggunakan file FASTA khusus yang berisi urutan transkrip non-coding (n = 305) yang ditemukan dalam dataset transkriptom 1000 serat (Gambar 5D). Kami mengidentifikasi 197 protein mikroba dari 22 transkrip berbeda, 71 di antaranya diatur secara berbeda antara serat otot rangka lambat dan cepat (Gambar Tambahan 9C dan Kumpulan Data Tambahan 16). Untuk LINC01405, tiga produk protein mikroba diidentifikasi, salah satunya menunjukkan spesifisitas serat lambat yang serupa dengan transkripnya (Gambar 5E dan Gambar Tambahan 9D). Dengan demikian, kami mengidentifikasi LINC01405 sebagai gen yang mengkode protein mikroba spesifik untuk serat otot rangka lambat.
Kami mengembangkan alur kerja komprehensif untuk karakterisasi proteomik skala besar dari serat otot individu dan mengidentifikasi regulator heterogenitas serat pada kondisi sehat. Kami menerapkan alur kerja ini untuk memahami bagaimana miopati nemalin memengaruhi heterogenitas serat otot rangka. Miopati nemalin adalah penyakit otot bawaan yang menyebabkan kelemahan otot dan, pada anak-anak yang terkena, menunjukkan berbagai komplikasi termasuk gangguan pernapasan, skoliosis, dan keterbatasan mobilitas anggota tubuh. 19,20 Biasanya, pada miopati nemalin, varian patogenik pada gen seperti aktin alfa 1 (ACTA1) menghasilkan dominasi komposisi serat otot tipe lambat, meskipun efek ini heterogen. Salah satu pengecualian yang penting adalah miopati nemalin troponin T1 (TNNT1), yang memiliki dominasi serat tipe cepat. Dengan demikian, pemahaman yang lebih baik tentang heterogenitas yang mendasari disregulasi serat otot rangka yang diamati pada miopati nemalin dapat membantu mengungkap hubungan kompleks antara penyakit ini dan jenis serat otot.
Dibandingkan dengan kontrol sehat (n=3 per kelompok), miofiber yang diisolasi dari pasien miopati nemaline dengan mutasi pada gen ACTA1 dan TNNT1 menunjukkan atrofi atau distrofi miofiber yang nyata (Gambar 6A, Tabel Tambahan 3). Hal ini menimbulkan tantangan teknis yang signifikan untuk analisis proteomik karena jumlah material yang tersedia terbatas. Meskipun demikian, kami mampu mendeteksi 2485 protein dalam 272 miofiber rangka. Setelah penyaringan untuk setidaknya 1000 protein terkuantifikasi per serat, 250 serat kemudian dianalisis secara bioinformatika. Setelah penyaringan, rata-rata 1573 ± 359 protein per serat terkuantifikasi (Gambar Tambahan 10A, Kumpulan Data Tambahan 17–18). Yang perlu diperhatikan, meskipun terjadi pengurangan ukuran serat yang signifikan, kedalaman proteom sampel pasien miopati nemaline hanya sedikit berkurang. Selain itu, pemrosesan data ini menggunakan berkas FASTA kami sendiri (termasuk transkrip non-pengkodean) memungkinkan kami untuk mengidentifikasi lima protein mikroba dalam miofiber rangka dari pasien miopati nemaline (Kumpulan Data Tambahan 19). Rentang dinamis proteom secara signifikan lebih luas, dan total protein dalam kelompok kontrol berkorelasi baik dengan hasil analisis proteom 1000 serat sebelumnya (Gambar Tambahan 10B–C).
A. Gambar mikroskopis yang menunjukkan atrofi atau distrofi serat dan dominasi berbagai jenis serat berdasarkan MYH pada miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1 (NM). Skala bar = 100 μm. Untuk memastikan reproduksibilitas pewarnaan pada pasien ACTA1 dan TNNT1, tiga biopsi pasien diwarnai dua hingga tiga kali (empat bagian per kasus) sebelum memilih gambar representatif. B. Proporsi jenis serat pada peserta berdasarkan MYH. C. Plot analisis komponen utama (PCA) serat otot rangka pada pasien dengan miopati nemaline dan kontrol. D. Serat otot rangka dari pasien dengan miopati nemaline dan kontrol diproyeksikan ke plot PCA yang ditentukan dari 1000 serat yang dianalisis pada Gambar 2. Misalnya, plot gunung berapi yang membandingkan perbedaan antara peserta dengan miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1 dan kontrol, dan antara peserta dengan miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1. Lingkaran berwarna menunjukkan protein yang berbeda secara signifikan pada π < 0,05, dan titik gelap menunjukkan protein yang berbeda secara signifikan pada FDR < 0,05. Analisis statistik dilakukan menggunakan metode model linier Limma dan metode Bayesian empiris, diikuti dengan penyesuaian nilai p untuk perbandingan berganda menggunakan metode Benjamini-Hochberg. H. Analisis pengayaan protein yang diekspresikan secara berbeda secara signifikan di seluruh proteom dan pada serat tipe 1 dan 2A. Analisis statistik dilakukan menggunakan paket clusterProfiler dan nilai p yang disesuaikan dengan Benjamini-Hochberg. I, J. Plot analisis komponen utama (PCA) yang diwarnai berdasarkan istilah ontologi gen (GO) matriks ekstraseluler dan mitokondria.
Karena miopati nemaline dapat memengaruhi proporsi tipe miofiber yang mengekspresikan MYH pada otot rangka,19,20 kami pertama-tama memeriksa tipe miofiber yang mengekspresikan MYH pada pasien dengan miopati nemaline dan kontrol. Kami menentukan tipe miofiber menggunakan metode yang tidak bias yang sebelumnya dijelaskan untuk uji 1000 miofiber (Gambar Tambahan 10D–E) dan sekali lagi gagal mengidentifikasi miofiber 2X murni (Gambar 6B). Kami mengamati efek heterogen dari miopati nemaline pada tipe miofiber, karena dua pasien dengan mutasi ACTA1 memiliki peningkatan proporsi miofiber tipe 1, sedangkan dua pasien dengan miopati nemaline TNNT1 memiliki penurunan proporsi miofiber tipe 1 (Gambar 6B). Memang, ekspresi MYH2 dan isoform troponin cepat (TNNC2, TNNI2, dan TNNT3) menurun pada miopati nemaline ACTA1, sedangkan ekspresi MYH7 menurun pada miopati nemaline TNNT1 (Gambar Tambahan 11A). Hal ini konsisten dengan laporan sebelumnya tentang peralihan tipe miofiber heterogen pada miopati nemaline.19,20 Kami mengkonfirmasi hasil ini dengan imunohistokimia dan menemukan bahwa pasien dengan miopati nemaline ACTA1 memiliki dominasi miofiber tipe 1, sedangkan pasien dengan miopati nemaline TNNT1 memiliki pola sebaliknya (Gambar 6A).
Pada tingkat proteom serat tunggal, serat otot rangka dari pasien miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1 mengelompok dengan sebagian besar serat kontrol, dengan serat miopati nemaline TNNT1 umumnya paling parah terpengaruh (Gambar 6C). Hal ini sangat jelas terlihat ketika memplot plot analisis komponen utama (PCA) dari serat pseudo-inflated untuk setiap pasien, dengan pasien miopati nemaline TNNT1 2 dan 3 tampak paling jauh dari sampel kontrol (Gambar Tambahan 11B, Kumpulan Data Tambahan 20). Untuk lebih memahami bagaimana serat dari pasien miopati dibandingkan dengan serat sehat, kami menggunakan informasi rinci yang diperoleh dari analisis proteomik 1.000 serat dari peserta dewasa sehat. Kami memproyeksikan serat dari dataset miopati (pasien miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1 dan kontrol) ke plot PCA yang diperoleh dari analisis proteomik 1000 serat (Gambar 6D). Distribusi tipe serat MYH di sepanjang PC2 pada serat kontrol serupa dengan distribusi serat yang diperoleh dari analisis proteomik 1000 serat. Namun, sebagian besar serat pada pasien miopati nemaline bergeser ke bawah PC2, tumpang tindih dengan serat fast-twitch sehat, terlepas dari tipe serat MYH aslinya. Dengan demikian, meskipun pasien dengan miopati nemaline ACTA1 menunjukkan pergeseran ke arah serat tipe 1 ketika dikuantifikasi menggunakan metode berbasis MYH, baik miopati nemaline ACTA1 maupun miopati nemaline TNNT1 menggeser proteom serat otot rangka ke arah serat fast-twitch.
Kemudian, kami secara langsung membandingkan setiap kelompok pasien dengan kontrol sehat dan mengidentifikasi 256 dan 552 protein yang diekspresikan secara berbeda pada miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1, masing-masing (Gambar 6E–G dan Gambar Tambahan 11C, Kumpulan Data Tambahan 21). Analisis pengayaan gen mengungkapkan penurunan terkoordinasi pada protein mitokondria (Gambar 6H–I, Kumpulan Data Tambahan 22). Yang mengejutkan, meskipun terdapat perbedaan dominasi tipe serat pada miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1, penurunan ini sepenuhnya independen dari tipe serat berbasis MYH (Gambar 6H dan Gambar Tambahan 11D–I, Kumpulan Data Tambahan 23). Tiga protein mikroba juga diatur pada miopati nemaline ACTA1 atau TNNT1. Dua mikroprotein ini, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (juga dikenal sebagai LINC00598 atau Lnc-FOXO1) dan ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), menunjukkan kelimpahan diferensial hanya pada miofiber tipe 1. ENSG00000215483_TR14_ORF67 sebelumnya telah dilaporkan berperan dalam regulasi siklus sel. 56 Di sisi lain, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (sesuai dengan LINC01798) meningkat pada miofiber tipe 1 dan tipe 2A pada miopati ACTA1-nemaline dibandingkan dengan kontrol sehat (Gambar Tambahan 12A, Kumpulan Data Tambahan 24). Sebaliknya, protein ribosom sebagian besar tidak terpengaruh oleh miopati nemaline, meskipun RPS17 mengalami penurunan regulasi pada miopati nemaline ACTA1 (Gambar 6E).
Analisis pengayaan juga mengungkapkan peningkatan proses sistem imun pada miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1, sementara adhesi sel juga meningkat pada miopati nemaline TNNT1 (Gambar 6H). Pengayaan faktor ekstraseluler ini tercermin dari protein matriks ekstraseluler yang menggeser PCA di PC1 dan PC2 ke arah negatif (yaitu, menuju serat yang paling terpengaruh) (Gambar 6J). Kedua kelompok pasien menunjukkan peningkatan ekspresi protein ekstraseluler yang terlibat dalam respons imun dan mekanisme perbaikan sarkolema, seperti aneksina (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 dan protein interaksinya S100A1159 (Gambar Tambahan 12B–C). Proses ini sebelumnya telah dilaporkan meningkat pada distrofi otot60 tetapi, sepengetahuan kami, belum pernah dikaitkan dengan miopati nemaline. Fungsi normal dari mesin molekuler ini diperlukan untuk perbaikan sarkolema setelah cedera dan untuk fusi miosit yang baru terbentuk dengan miofiber58,61. Dengan demikian, peningkatan aktivitas proses ini pada kedua kelompok pasien menunjukkan respons perbaikan terhadap cedera yang disebabkan oleh ketidakstabilan miofiber.
Efek dari masing-masing miopati nemaline berkorelasi dengan baik (r = 0,736) dan menunjukkan tumpang tindih yang wajar (Gambar Tambahan 11A–B), menunjukkan bahwa miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1 memiliki efek serupa pada proteom. Namun, beberapa protein hanya diatur pada miopati nemaline ACTA1 atau TNNT1 (Gambar Tambahan 11A dan C). Protein profibrotik MFAP4 adalah salah satu protein yang paling meningkat pada miopati nemaline TNNT1 tetapi tetap tidak berubah pada miopati nemaline ACTA1. SKIC8, komponen kompleks PAF1C yang bertanggung jawab untuk mengatur transkripsi gen HOX, mengalami penurunan pada miopati nemaline TNNT1 tetapi tidak terpengaruh pada miopati nemaline ACTA1 (Gambar Tambahan 11A). Perbandingan langsung antara miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1 menunjukkan penurunan protein mitokondria yang lebih besar dan peningkatan protein sistem imun pada miopati nemaline TNNT1 (Gambar 6G–H dan Gambar Tambahan 11C dan 11H–I). Data ini konsisten dengan atrofi/distrofi yang lebih besar yang diamati pada miopati nemaline TNNT1 dibandingkan dengan miopati nemaline TNNT1 (Gambar 6A), menunjukkan bahwa miopati nemaline TNNT1 merupakan bentuk penyakit yang lebih parah.
Untuk menilai apakah efek miopati nemaline yang diamati tetap ada pada tingkat seluruh otot, kami melakukan analisis proteomik massal pada biopsi otot dari kohort pasien miopati nemaline TNNT1 yang sama dan membandingkannya dengan kontrol (n=3 per kelompok) (Gambar Tambahan 13A, Kumpulan Data Tambahan 25). Seperti yang diharapkan, kontrol memiliki hubungan yang erat dalam analisis komponen utama, sedangkan pasien miopati nemaline TNNT1 menunjukkan variabilitas antar sampel yang lebih tinggi serupa dengan yang terlihat dalam analisis serat tunggal (Gambar Tambahan 13B). Analisis massal mereproduksi protein yang diekspresikan secara berbeda (Gambar Tambahan 13C, Kumpulan Data Tambahan 26) dan proses biologis (Gambar Tambahan 13D, Kumpulan Data Tambahan 27) yang disorot dengan membandingkan serat individu, tetapi kehilangan kemampuan untuk membedakan antara berbagai jenis serat dan gagal menjelaskan efek penyakit heterogen di seluruh serat.
Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa proteomik serat otot tunggal dapat menjelaskan fitur biologis klinis yang tidak dapat dideteksi oleh metode yang ditargetkan seperti imunoblotting. Lebih jauh lagi, data ini menyoroti keterbatasan penggunaan penentuan tipe serat aktin (MYH) saja untuk menggambarkan adaptasi fenotipik. Memang, meskipun peralihan tipe serat berbeda antara miopati nemaline aktin dan troponin, kedua miopati nemaline tersebut memisahkan penentuan tipe serat MYH dari metabolisme serat otot rangka menuju proteom otot yang lebih cepat dan kurang oksidatif.
Heterogenitas seluler sangat penting bagi jaringan untuk memenuhi beragam kebutuhannya. Pada otot rangka, hal ini sering digambarkan sebagai tipe serat yang ditandai dengan tingkat produksi gaya dan kelelahan yang berbeda. Namun, jelas bahwa ini hanya menjelaskan sebagian kecil dari variabilitas serat otot rangka, yang jauh lebih bervariasi, kompleks, dan beragam daripada yang diperkirakan sebelumnya. Kemajuan teknologi kini telah memberikan wawasan tentang faktor-faktor yang mengatur serat otot rangka. Memang, data kami menunjukkan bahwa serat tipe 2X mungkin bukan subtipe serat otot rangka yang berbeda. Selain itu, kami mengidentifikasi protein metabolik, protein ribosom, dan protein terkait sel sebagai penentu utama heterogenitas serat otot rangka. Dengan menerapkan alur kerja proteomik kami pada sampel pasien dengan miopati nematoda, kami lebih lanjut menunjukkan bahwa penentuan tipe serat berdasarkan MYH tidak sepenuhnya mencerminkan heterogenitas otot rangka, terutama ketika sistem terganggu. Memang, terlepas dari tipe serat berbasis MYH, miopati nematoda mengakibatkan pergeseran ke arah serat yang lebih cepat dan kurang oksidatif.
Serat otot rangka telah diklasifikasikan sejak abad ke-19. Analisis omik terbaru memungkinkan kita untuk mulai memahami profil ekspresi berbagai tipe serat MYH dan responsnya terhadap berbagai rangsangan. Seperti yang dijelaskan di sini, pendekatan omik juga memiliki keunggulan sensitivitas yang lebih besar untuk mengukur penanda tipe serat daripada metode berbasis antibodi tradisional, tanpa bergantung pada kuantifikasi satu (atau beberapa) penanda untuk mendefinisikan tipe serat otot rangka. Kami menggunakan alur kerja transkriptomik dan proteomik yang saling melengkapi dan mengintegrasikan hasilnya untuk memeriksa regulasi transkripsional dan pasca-transkripsional heterogenitas serat pada serat otot rangka manusia. Alur kerja ini menghasilkan kegagalan untuk mengidentifikasi serat tipe 2X murni pada tingkat protein di vastus lateralis pada kelompok pria muda sehat kami. Hal ini konsisten dengan studi serat tunggal sebelumnya yang menemukan <1% serat 2X murni di vastus lateralis yang sehat, meskipun hal ini perlu dikonfirmasi pada otot lain di masa mendatang. Perbedaan antara deteksi serat 2X yang hampir murni pada tingkat mRNA dan hanya serat 2A/2X campuran pada tingkat protein membingungkan. Ekspresi mRNA isoform MYH tidak bersifat sirkadian,67 menunjukkan bahwa kita kemungkinan besar tidak "melewatkan" sinyal awal MYH2 pada serat 2X yang tampaknya murni pada tingkat RNA. Salah satu penjelasan yang mungkin, meskipun murni hipotetis, bisa jadi perbedaan stabilitas protein dan/atau mRNA antara isoform MYH. Memang, tidak ada serat cepat yang 100% murni untuk isoform MYH apa pun, dan tidak jelas apakah tingkat ekspresi mRNA MYH1 dalam kisaran 70–90% akan menghasilkan kelimpahan MYH1 dan MYH2 yang sama pada tingkat protein. Namun, ketika mempertimbangkan seluruh transkriptom atau proteom, analisis klaster dapat dengan yakin mengidentifikasi hanya dua klaster berbeda yang mewakili serat otot rangka lambat dan cepat, terlepas dari komposisi MYH yang tepat. Hal ini konsisten dengan analisis yang menggunakan pendekatan transkriptomik nukleus tunggal, yang biasanya hanya mengidentifikasi dua kelompok mionuklear yang berbeda. 68, 69, 70 Lebih lanjut, meskipun studi proteomik sebelumnya telah mengidentifikasi serat tipe 2X, serat-serat ini tidak mengelompok secara terpisah dari serat cepat lainnya dan hanya menunjukkan sejumlah kecil protein yang berbeda kelimpahannya dibandingkan dengan jenis serat lain berdasarkan MYH. 14 Hasil ini menunjukkan bahwa kita harus kembali ke pandangan klasifikasi serat otot pada awal abad ke-20, yang membagi serat otot rangka manusia bukan menjadi tiga kelas berbeda berdasarkan MYH, tetapi menjadi dua kelompok berdasarkan sifat metabolik dan kontraktilnya. 63
Yang lebih penting, heterogenitas miofiber harus dipertimbangkan dalam berbagai dimensi. Studi "omics" sebelumnya telah mengarah ke arah ini, menunjukkan bahwa serat otot rangka tidak membentuk kelompok diskrit tetapi tersusun sepanjang kontinum. 11, 13, 14, 64, 71 Di sini, kami menunjukkan bahwa, selain perbedaan sifat kontraktil dan metabolik otot rangka, miofiber dapat dibedakan berdasarkan fitur yang terkait dengan interaksi sel-sel dan mekanisme translasi. Memang, kami menemukan heterogenitas ribosom dalam serat otot rangka yang berkontribusi pada heterogenitas yang independen dari tipe serat lambat dan cepat. Penyebab mendasar dari heterogenitas miofiber yang substansial ini, yang independen dari tipe serat lambat dan cepat, masih belum jelas, tetapi mungkin menunjukkan organisasi spasial khusus dalam fasikel otot yang secara optimal merespons gaya dan beban tertentu,72 komunikasi seluler atau organ spesifik dengan tipe sel lain di lingkungan mikro otot73,74,75 atau perbedaan aktivitas ribosom dalam miofiber individu. Memang, heteroplasmi ribosom, baik melalui substitusi paralogus RPL3 dan RPL3L atau pada tingkat 2′O-metilasi rRNA, telah terbukti berhubungan dengan hipertrofi otot rangka76,77. Aplikasi multi-omik dan spasial yang dikombinasikan dengan karakterisasi fungsional miofiber individu akan semakin memajukan pemahaman kita tentang biologi otot pada tingkat multi-omik78.
Dengan menganalisis proteom serat otot tunggal dari pasien dengan miopati nemaline, kami juga menunjukkan kegunaan, efektivitas, dan penerapan proteomik serat otot tunggal untuk menjelaskan patofisiologi klinis otot rangka. Selain itu, dengan membandingkan alur kerja kami dengan analisis proteomik global, kami dapat menunjukkan bahwa proteomik serat otot tunggal menghasilkan kedalaman informasi yang sama dengan proteomik jaringan global dan memperluas kedalaman ini dengan memperhitungkan heterogenitas antar serat dan tipe serat otot. Selain perbedaan yang diharapkan (walaupun bervariasi) dalam rasio tipe serat yang diamati pada miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1 dibandingkan dengan kontrol sehat,19 kami juga mengamati remodeling oksidatif dan ekstraseluler yang independen dari peralihan tipe serat yang dimediasi MYH. Fibrosis sebelumnya telah dilaporkan pada miopati nemaline TNNT1.19 Namun, analisis kami memperkuat temuan ini dengan juga mengungkapkan peningkatan kadar protein terkait stres yang disekresikan secara ekstraseluler, seperti aneksina, yang terlibat dalam mekanisme perbaikan sarkolema, pada miofiber dari pasien dengan miopati nemaline ACTA1 dan TNNT1.57,58,59 Kesimpulannya, peningkatan kadar aneksina pada miofiber dari pasien dengan miopati nemaline dapat mewakili respons seluler untuk memperbaiki miofiber yang mengalami atrofi parah.
Meskipun penelitian ini merupakan analisis omik seluruh otot serat tunggal terbesar pada manusia hingga saat ini, penelitian ini bukannya tanpa keterbatasan. Kami mengisolasi serat otot rangka dari sampel peserta yang relatif kecil dan homogen serta satu otot (vastus lateralis). Oleh karena itu, tidak mungkin untuk mengesampingkan keberadaan populasi serat spesifik di berbagai jenis otot dan pada kondisi ekstrem fisiologi otot. Misalnya, kami tidak dapat mengesampingkan kemungkinan munculnya subset serat ultra cepat (misalnya, serat 2X murni) pada pelari cepat dan/atau atlet kekuatan yang sangat terlatih79 atau selama periode tidak aktifnya otot66,80. Selain itu, ukuran sampel peserta yang terbatas mencegah kami untuk menyelidiki perbedaan jenis kelamin dalam heterogenitas serat, karena rasio jenis serat diketahui berbeda antara pria dan wanita. Lebih lanjut, kami tidak dapat melakukan analisis transkriptomik dan proteomik pada serat otot atau sampel yang sama dari peserta yang sama. Seiring dengan upaya kami dan pihak lain untuk terus mengoptimalkan analisis sel tunggal dan serat otot tunggal menggunakan analisis omik untuk mencapai input sampel yang sangat rendah (seperti yang ditunjukkan di sini dalam analisis serat dari pasien dengan miopati mitokondrial), peluang untuk menggabungkan pendekatan multi-omik (dan fungsional) dalam serat otot tunggal menjadi jelas.
Secara keseluruhan, data kami mengidentifikasi dan menjelaskan pendorong transkripsional dan pasca-transkripsional dari heterogenitas otot rangka. Secara khusus, kami menyajikan data yang menantang dogma lama dalam fisiologi otot rangka yang terkait dengan definisi tipe serat berbasis MYH klasik. Kami berharap dapat memperbarui debat dan pada akhirnya memikirkan kembali pemahaman kita tentang klasifikasi dan heterogenitas serat otot rangka.
Empat belas partisipan Kaukasia (12 pria dan 2 wanita) secara sukarela setuju untuk berpartisipasi dalam penelitian ini. Penelitian ini disetujui oleh Komite Etika Rumah Sakit Universitas Ghent (BC-10237), sesuai dengan Deklarasi Helsinki 2013, dan terdaftar di ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Karakteristik umum partisipan disajikan dalam Tabel Tambahan 1. Setelah mendapatkan persetujuan lisan dan tertulis, partisipan menjalani pemeriksaan medis sebelum dimasukkan dalam penelitian. Partisipan berusia muda (22–42 tahun), sehat (tidak memiliki kondisi medis, tidak memiliki riwayat merokok), dan cukup aktif secara fisik. Pengambilan oksigen maksimal ditentukan menggunakan ergometer langkah untuk menilai kebugaran fisik seperti yang dijelaskan sebelumnya. 81
Sampel biopsi otot dikumpulkan saat istirahat dan dalam keadaan puasa sebanyak tiga kali, dengan jarak 14 hari. Karena sampel ini dikumpulkan sebagai bagian dari studi yang lebih besar, peserta mengonsumsi plasebo (laktosa), antagonis reseptor H1 (540 mg fexofenadine), atau antagonis reseptor H2 (40 mg famotidine) 40 menit sebelum biopsi. Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa antagonis reseptor histamin ini tidak memengaruhi kebugaran otot rangka saat istirahat81, dan tidak ada pengelompokan terkait keadaan yang diamati dalam plot kontrol kualitas kami (Gambar Tambahan 3 dan 6). Diet standar (41,4 kkal/kg berat badan, 5,1 g/kg berat badan karbohidrat, 1,4 g/kg berat badan protein, dan 1,6 g/kg berat badan lemak) dipertahankan selama 48 jam sebelum setiap hari percobaan, dan sarapan standar (1,5 g/kg berat badan karbohidrat) dikonsumsi pada pagi hari percobaan. Di bawah anestesi lokal (0,5 ml lidokain 1% tanpa epinefrin), biopsi otot diperoleh dari otot vastus lateralis menggunakan aspirasi Bergström perkutan.82 Sampel otot segera dibenamkan dalam RNAlater dan disimpan pada suhu 4°C hingga dilakukan diseksi serat secara manual (hingga 3 hari).
Bundel miofiber yang baru diisolasi dipindahkan ke media RNAlater segar dalam cawan kultur. Miofiber individual kemudian dipisahkan secara manual menggunakan mikroskop stereo dan pinset halus. Dua puluh lima serat dipisahkan dari setiap biopsi, dengan memperhatikan secara khusus pemilihan serat dari area biopsi yang berbeda. Setelah pemisahan, setiap serat direndam perlahan dalam 3 μl buffer lisis (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) yang mengandung enzim proteinase K dan DNase untuk menghilangkan protein dan DNA yang tidak diinginkan. Lisis sel dan penghilangan protein/DNA kemudian dimulai dengan pengadukan singkat menggunakan vortex, memutar cairan dalam mikrosentrifuga, dan inkubasi pada suhu kamar (10 menit). Lisat kemudian diinkubasi dalam thermal cycler (T100, Bio-Rad) pada suhu 37°C selama 5 menit, 75°C selama 5 menit, dan kemudian segera disimpan pada suhu -80°C hingga diproses lebih lanjut.
Pustaka RNA poliadenilasi yang kompatibel dengan Illumina disiapkan dari 2 µl lisat serat otot menggunakan Kit Persiapan Pustaka mRNA-Seq QuantSeq-Pool 3′ (Lexogen). Metode terperinci dapat ditemukan dalam manual pabrikan. Proses dimulai dengan sintesis cDNA untai pertama melalui transkripsi balik, di mana pengidentifikasi molekuler unik (UMI) dan barcode i1 spesifik sampel dimasukkan untuk memastikan penggabungan sampel dan mengurangi variabilitas teknis selama pemrosesan selanjutnya. cDNA dari 96 serat otot kemudian digabungkan dan dimurnikan dengan manik-manik magnetik, setelah itu RNA dihilangkan dan sintesis untai kedua dilakukan menggunakan primer acak. Pustaka dimurnikan dengan manik-manik magnetik, tag i5/i7 spesifik kumpulan ditambahkan, dan diamplifikasi dengan PCR. Langkah pemurnian akhir menghasilkan pustaka yang kompatibel dengan Illumina. Kualitas setiap kumpulan pustaka dinilai menggunakan Kit Analisis DNA Fragmen Kecil Sensitivitas Tinggi (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Berdasarkan kuantifikasi Qubit, kumpulan tersebut selanjutnya dikumpulkan pada konsentrasi ekimolar (2 nM). Kumpulan yang dihasilkan kemudian diurutkan pada instrumen NovaSeq 6000 dalam mode standar menggunakan Kit Reagen NovaSeq S2 (1 × 100 nukleotida) dengan pemuatan 2 nM (4% PhiX).
Pipeline kami didasarkan pada pipeline analisis data QuantSeq Pool dari Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data pertama kali didemultipleks dengan bcl2fastq2 (v2.20.0) berdasarkan indeks i7/i5. Read 2 kemudian didemultipleks dengan idemux (v0.1.6) berdasarkan barcode sampel i1 dan sekuens UMI diekstrak dengan umi_tools (v1.0.1). Read kemudian dipangkas dengan cutadapt (v3.4) dalam beberapa putaran untuk menghilangkan read pendek (<20 panjangnya) atau read yang hanya terdiri dari sekuens adapter. Read kemudian disejajarkan dengan genom manusia menggunakan STAR (v2.6.0c) dan file BAM diindeks dengan SAMtools (v1.11). Read duplikat dihapus menggunakan umi_tools (v1.0.1). Terakhir, penghitungan keselarasan dilakukan menggunakan featureCounts di Subread (v2.0.3). Kontrol kualitas dilakukan menggunakan FastQC (v0.11.9) pada beberapa tahap perantara dalam alur kerja.
Semua pemrosesan dan visualisasi bioinformatika lebih lanjut dilakukan di R (v4.2.3), terutama menggunakan alur kerja Seurat (v4.4.0). 83 Oleh karena itu, nilai UMI individual dan matriks metadata diubah menjadi objek Seurat. Gen yang diekspresikan kurang dari 30% dari semua serat dihilangkan. Sampel berkualitas rendah dihilangkan berdasarkan ambang batas minimum 1000 nilai UMI dan 1000 gen yang terdeteksi. Pada akhirnya, 925 serat lolos semua langkah penyaringan kontrol kualitas. Nilai UMI dinormalisasi menggunakan metode Seurat SCTransform v2, 84 termasuk semua 7418 fitur yang terdeteksi, dan perbedaan antar partisipan dihilangkan melalui regresi. Semua metadata yang relevan dapat ditemukan di Dataset Tambahan 28.
Waktu posting: 10 September 2025