Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk hasil terbaik, kami sarankan Anda menggunakan versi peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya atau JavaScript.
Pertumbuhan mikroba pada luka seringkali bermanifestasi sebagai biofilm, yang mengganggu penyembuhan dan sulit diberantas. Perban perak baru diklaim dapat mengatasi infeksi luka, tetapi kemanjuran antibiofilm dan efek penyembuhan yang tidak bergantung pada infeksi umumnya tidak diketahui. Dengan menggunakan model biofilm in vitro dan in vivo dari Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa, kami melaporkan efektivitas perban penghasil ion Ag1+; perban Ag1+ yang mengandung asam etilenediaminetetraasetat dan benzethonium klorida (Ag1+/EDTA/BC), dan perban yang mengandung perak nitrat (Ag oxysalts), yang menghasilkan ion Ag1+, Ag2+, dan Ag3+ untuk melawan biofilm luka dan pengaruhnya terhadap penyembuhan. Perban Ag1+ memiliki efek minimal pada biofilm luka secara in vitro dan pada tikus (C57BL/6j). Sebaliknya, garam Ag teroksigenasi dan perban Ag1+/EDTA/BC secara signifikan mengurangi jumlah bakteri hidup dalam biofilm secara in vitro dan menunjukkan pengurangan signifikan pada komponen bakteri dan EPS dalam biofilm luka tikus. Perban ini memiliki efek yang berbeda pada penyembuhan luka yang terinfeksi biofilm dan yang tidak terinfeksi biofilm, dengan perban garam teroksigenasi memiliki efek yang lebih bermanfaat pada reepitelisasi, ukuran luka, dan peradangan dibandingkan dengan perawatan kontrol dan perban perak lainnya. Sifat fisikokimia yang berbeda dari perban perak dapat memiliki efek yang berbeda pada biofilm luka dan penyembuhan, dan hal ini harus dipertimbangkan ketika memilih perban untuk perawatan luka yang terinfeksi biofilm.
Luka kronis didefinisikan sebagai “luka yang gagal melewati tahapan penyembuhan normal secara teratur dan tepat waktu” 1. Luka kronis menimbulkan beban psikologis, sosial, dan ekonomi bagi pasien dan sistem perawatan kesehatan. Pengeluaran tahunan NHS untuk pengobatan luka dan komorbiditas terkait diperkirakan mencapai £8,3 miliar pada tahun 2017–182. Luka kronis juga saat ini menjadi masalah mendesak di Amerika Serikat, dengan Medicare memperkirakan biaya tahunan pengobatan pasien dengan luka sebesar $28,1–$96,8 miliar3.
Infeksi merupakan faktor utama yang menghambat penyembuhan luka. Infeksi seringkali bermanifestasi sebagai biofilm, yang terdapat pada 78% luka kronis yang tidak kunjung sembuh. Biofilm terbentuk ketika mikroorganisme melekat secara permanen pada permukaan, seperti permukaan luka, dan dapat menggumpal membentuk komunitas penghasil polimer ekstraseluler (EPS). Biofilm luka dikaitkan dengan peningkatan respons inflamasi yang menyebabkan kerusakan jaringan, yang dapat menunda atau mencegah penyembuhan⁴. Peningkatan kerusakan jaringan mungkin sebagian disebabkan oleh peningkatan aktivitas matriks metaloproteinase, kolagenase, elastase, dan spesies oksigen reaktif⁵. Selain itu, sel inflamasi dan biofilm itu sendiri merupakan konsumen oksigen yang tinggi dan oleh karena itu dapat menyebabkan hipoksia jaringan lokal, yang mengurangi oksigen vital yang dibutuhkan sel untuk perbaikan jaringan yang efektif⁶.
Biofilm yang matang sangat resisten terhadap agen antimikroba, sehingga memerlukan strategi agresif untuk mengendalikan infeksi biofilm, seperti perawatan mekanis diikuti dengan perawatan antimikroba yang efektif. Karena biofilm dapat beregenerasi dengan cepat, antimikroba yang efektif dapat mengurangi risiko pembentukan kembali setelah debridemen bedah7.
Perak semakin banyak digunakan dalam perban antimikroba dan sering digunakan sebagai pengobatan lini pertama untuk luka infeksi kronis. Terdapat banyak perban perak yang tersedia secara komersial, masing-masing mengandung komposisi, konsentrasi, dan matriks dasar perak yang berbeda. Kemajuan dalam perban perak telah mengarah pada pengembangan perban perak baru. Bentuk logam perak (Ag0) bersifat inert; untuk mencapai efektivitas antimikroba, ia harus kehilangan elektron untuk membentuk perak ionik (Ag1+). Perban perak tradisional mengandung senyawa perak atau perak logam yang, ketika terpapar cairan, terurai membentuk ion Ag1+. Ion Ag1+ ini bereaksi dengan sel bakteri, menghilangkan elektron dari komponen struktural atau proses penting yang diperlukan untuk bertahan hidup. Teknologi yang dipatenkan telah mengarah pada pengembangan senyawa perak baru, garam oksida Ag (perak nitrat, Ag7NO11), yang termasuk dalam perban luka. Tidak seperti perak tradisional, dekomposisi garam yang mengandung oksigen menghasilkan keadaan perak dengan valensi lebih tinggi (Ag1+, Ag2+ dan Ag3+). Studi in vitro menunjukkan bahwa konsentrasi rendah garam perak teroksigenasi lebih efektif daripada perak ion tunggal (Ag1+) terhadap bakteri patogen seperti Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, dan Escherichia coli8,9. Jenis perban perak baru lainnya mencakup bahan tambahan, yaitu asam etilenediaminetetraasetat (EDTA) dan benzethonium klorida (BC), yang dilaporkan menargetkan EPS biofilm dan dengan demikian meningkatkan penetrasi perak ke dalam biofilm. Teknologi perak baru ini menawarkan cara baru untuk menargetkan biofilm luka. Namun, dampak antimikroba ini pada lingkungan luka dan penyembuhan independen infeksi penting untuk memastikan bahwa mereka tidak menciptakan lingkungan luka yang tidak menguntungkan atau menunda penyembuhan. Kekhawatiran tentang sitotoksisitas perak in vitro telah dilaporkan pada beberapa perban perak10,11. Namun, sitotoksisitas in vitro belum diterjemahkan menjadi toksisitas in vivo, dan beberapa perban Ag1+ telah menunjukkan profil keamanan yang baik12.
Di sini, kami menyelidiki efektivitas perban karboksimetilselulosa yang mengandung formulasi perak baru terhadap biofilm luka secara in vitro dan in vivo. Selain itu, efek perban ini terhadap respons imun dan penyembuhan yang independen dari infeksi juga dinilai.
Semua perban yang digunakan tersedia secara komersial. Perban Serat Gel 3M Kerracel (3M, Knutsford, UK) adalah perban serat gel 100% karboksimetilselulosa (CMC) non-antimikroba yang digunakan sebagai perban kontrol dalam penelitian ini. Tiga perban perak CMC antimikroba dievaluasi, yaitu perban 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, UK), yang mengandung 1,7% berat garam perak teroksigenasi (Ag7NO11) dalam ion perak bervalensi lebih tinggi (Ag1+, Ag2+ dan Ag3+). Selama dekomposisi Ag7NO11, ion Ag1+, Ag2+ dan Ag3+ terbentuk dalam rasio 1:2:4. Pembalut Aquacel Ag Extra yang mengandung 1,2% perak klorida (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, UK) 13 dan pembalut Aquacel Ag + Extra yang mengandung 1,2% perak klorida (Ag1+), EDTA dan benzethonium klorida (ConvaTec, Deeside, UK) 14.
Strain yang digunakan dalam penelitian ini adalah Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) dan Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakteri ditumbuhkan semalaman dalam kaldu Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, UK). Kultur semalaman kemudian diencerkan 1:100 dalam kaldu Mueller-Hinton dan 200 µl dioleskan ke membran siklopori Whatman 0,2 µm steril (Whatman plc, Maidstone, UK) pada cawan agar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Britania Raya). Pembentukan biofilm kolonial pada suhu 37°C selama 24 jam. Biofilm kolonial ini diuji untuk penyusutan logaritmik.
Potong perban menjadi potongan persegi berukuran 3 cm² dan basahi terlebih dahulu dengan air deionisasi steril. Letakkan perban di atas biofilm koloni pada cawan agar. Setiap 24 ha biofilm dihilangkan, dan bakteri hidup di dalam biofilm (CFU/ml) dikuantifikasi dengan pengenceran serial (10⁻¹ hingga 10⁻⁷) dalam kaldu netralisasi Day-Angle (Merck-Millipore). Setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, penghitungan koloni standar dilakukan pada cawan agar Mueller-Hinton. Setiap perlakuan dan titik waktu dilakukan sebanyak tiga kali, dan penghitungan koloni diulang untuk setiap pengenceran.
Kulit perut babi diperoleh dari babi betina Large White dalam waktu 15 menit setelah penyembelihan sesuai dengan standar ekspor Uni Eropa. Kulit dicukur dan dibersihkan dengan tisu alkohol, kemudian dibekukan pada suhu -80°C selama 24 jam untuk mematikan vitalitas kulit. Setelah dicairkan, potongan kulit seluas 1 cm2 dicuci tiga kali dengan PBS, natrium hipoklorit 0,6%, dan etanol 70% selama 20 menit setiap kali. Sebelum mengangkat epidermis, hilangkan sisa etanol dengan mencuci 3 kali dalam PBS steril. Kulit dikultur dalam cawan petri 6 sumur dengan membran nilon setebal 0,45 μm (Merck-Millipore) di atasnya dan 3 bantalan penyerap (Merck-Millipore) yang berisi 3 ml serum janin sapi (Sigma) yang ditambah dengan 10% medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Biofilm koloni ditumbuhkan seperti yang dijelaskan untuk studi paparan biofilm. Setelah mengkultur biofilm pada membran selama 72 jam, biofilm diaplikasikan ke permukaan kulit menggunakan jarum inokulasi steril dan membran dilepas. Biofilm kemudian diinkubasi pada dermis babi selama 24 jam tambahan pada suhu 37°C untuk memungkinkan biofilm matang dan menempel pada kulit babi. Setelah biofilm matang dan menempel, balutan seluas 1,5 cm2, yang telah dibasahi sebelumnya dengan air suling steril, diaplikasikan langsung ke permukaan kulit dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Bakteri yang hidup divisualisasikan dengan pewarnaan dengan mengaplikasikan reagen viabilitas sel PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) secara merata ke permukaan apikal setiap eksplan dan menginkubasinya selama 5 menit. Gunakan kamera digital Leica DFC425 untuk langsung mengambil gambar pada mikroskop Leica MZ8. Area yang berwarna merah muda diukur menggunakan perangkat lunak Image Pro versi 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Mikroskop elektron pemindaian dilakukan seperti yang dijelaskan di bawah ini.
Bakteri yang ditumbuhkan semalaman diencerkan 1:100 dalam kaldu Mueller-Hinton. 200 μl kultur ditambahkan ke membran siklopori Whatman 0,2 μm steril (Whatman, Maidstone, UK) dan ditanam pada agar Mueller-Hinton. Pelat biofilm diinkubasi pada suhu 37°C selama 72 jam untuk memungkinkan pembentukan biofilm yang matang.
Setelah 3 hari pematangan biofilm, perban persegi berukuran 3 cm2 ditempatkan langsung di atas biofilm dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah melepaskan perban dari permukaan biofilm, 1 ml Reagen Viabilitas Sel PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA) ditambahkan ke permukaan setiap biofilm selama 20 detik. Permukaan dikeringkan sebelum perubahan warna direkam menggunakan kamera digital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Siapkan kultur semalaman pada agar Mueller-Hinton, pindahkan koloni individual ke 10 ml kaldu Mueller-Hinton dan inkubasi pada pengocok pada suhu 37°C (100 rpm). Setelah inkubasi semalaman, kultur diencerkan 1:100 dalam kaldu Mueller-Hinton dan 300 µl diteteskan ke membran Whatman cyclopore melingkar 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, UK) pada agar Mueller-Hinton dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 72 jam. Biofilm yang matang diaplikasikan pada luka seperti yang dijelaskan di bawah ini.
Semua pekerjaan yang melibatkan hewan dilakukan di Universitas Manchester di bawah lisensi proyek yang disetujui oleh Kantor Kesejahteraan Hewan dan Peninjauan Etika (P8721BD27) dan sesuai dengan pedoman yang diterbitkan oleh Kementerian Dalam Negeri di bawah ASPA revisi 2012. Semua penulis mematuhi pedoman kedatangan. Tikus C57BL/6j berusia delapan minggu (Envigo, Oxon, Inggris) digunakan untuk semua studi in vivo. Tikus dibius dengan isoflurane (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Inggris) dan permukaan punggungnya dicukur dan dibersihkan. Setiap tikus kemudian diberi luka eksisi 2 × 6 mm menggunakan alat biopsi Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Inggris). Untuk luka yang terinfeksi biofilm, aplikasikan biofilm koloni yang tumbuh selama 72 jam pada membran seperti yang dijelaskan di atas ke lapisan dermal luka menggunakan jarum inokulasi steril segera setelah cedera dan buang membran tersebut. Satu sentimeter persegi perban dibasahi terlebih dahulu dengan air steril untuk menjaga lingkungan luka tetap lembap. Perban diaplikasikan langsung ke setiap luka dan ditutup dengan film 3M Tegaderm (3M, Bracknell, UK) dan perekat cair Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) yang diaplikasikan di sekitar tepinya untuk memberikan daya rekat tambahan. Buprenorfin (Animalcare, York, UK) diberikan dengan konsentrasi 0,1 mg/kg sebagai analgesik. Tikus dikorbankan tiga hari setelah cedera menggunakan metode Jadwal 1 dan area luka diangkat, dibelah dua, dan disimpan sesuai kebutuhan.
Pewarnaan hematoksilin (ThermoFisher Scientific) dan eosin (ThermoFisher Scientific) dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan. Luas luka dan reepitelisasi diukur menggunakan perangkat lunak Image Pro versi 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Potongan jaringan dihilangkan lilinnya dalam xylene (ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK), dihidrasi ulang dengan etanol bertingkat 100–50%, dan direndam sebentar dalam air deionisasi (ThermoFisher Scientific). Imunohistokimia dilakukan menggunakan kit VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) sesuai dengan protokol pabrikan. Antibodi primer terhadap neutrofil NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) dan makrofag Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) diencerkan 1:100 dalam larutan penghambat dan ditambahkan ke permukaan potongan, diikuti oleh 2 antibodi Anti-, VectaStain ABC dan kit substrat Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) dan diwarnai dengan hematoksilin. Gambar diperoleh menggunakan mikroskop Olympus BX43 dan kamera digital Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Inggris).
Sampel kulit difiksasi dalam larutan glutaraldehida 2,5% dan formaldehida 4% dalam HEPES 0,1 M (pH 7,4) selama 24 jam pada suhu 4°C. Sampel didehidrasi menggunakan etanol bertingkat dan dikeringkan dalam CO2 menggunakan pengering titik kritis Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) dan dilapisi dengan paduan emas-paladium menggunakan sistem sputter/pelepasan pijar mini Quorum SC7620. Spesimen diimajinasikan menggunakan mikroskop elektron pemindai FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) untuk memvisualisasikan titik pusat luka.
Toto-1 iodida (2 μM) diaplikasikan pada permukaan luka tikus yang telah dieksisi dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 °C (ThermoFisher Scientific) dan diberi perlakuan dengan Syto-60 (10 μM) pada suhu 37 °C (ThermoFisher Scientific). Gambar Z-stack 15 menit dibuat menggunakan Leica TCS SP8.
Data replikasi biologis dan teknis ditabulasi dan dianalisis menggunakan perangkat lunak Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Analisis varians satu arah dengan perbandingan berganda menggunakan uji post hoc Dunnett digunakan untuk menguji perbedaan antara setiap perlakuan dan pembalut kontrol non-antimikroba. Nilai p < 0,05 dianggap signifikan.
Efektivitas balutan serat gel perak pertama kali dinilai terhadap koloni biofilm Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa secara in vitro. Balutan perak mengandung formula perak yang berbeda: balutan perak tradisional menghasilkan ion Ag1+; balutan perak, yang dapat menghasilkan ion Ag1+ setelah penambahan EDTA/BC, dapat menghancurkan matriks biofilm dan memaparkan bakteri pada perak di bawah efek antibakteri ion perak15 dan balutan yang mengandung garam Ag teroksigenasi yang menghasilkan ion Ag1+, Ag2+ dan Ag3+. Efektivitasnya dibandingkan dengan balutan kontrol non-antimikroba yang terbuat dari serat gel. Bakteri hidup yang tersisa di dalam biofilm dinilai setiap 24 jam selama 8 hari (Gambar 1). Pada hari ke-5, biofilm diinokulasi ulang dengan 3,85 × 10⁵ S. Staphylococcus aureus atau 1,22 × 10⁵ P. aeruginosa untuk menilai pemulihan biofilm. Dibandingkan dengan balutan kontrol non-antimikroba, balutan Ag1+ memiliki efek minimal pada viabilitas bakteri dalam biofilm Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa selama 5 hari. Sebaliknya, balutan yang mengandung Ag teroksigenasi dan garam Ag1+ + EDTA/BC efektif membunuh bakteri dalam biofilm dalam waktu 5 hari. Setelah inokulasi berulang dengan bakteri planktonik pada hari ke-5, tidak ada pemulihan biofilm yang diamati (Gambar 1).
Kuantifikasi bakteri hidup dalam biofilm Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa setelah perawatan dengan balutan perak. Koloni biofilm Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa dirawat dengan balutan perak atau balutan kontrol non-antimikroba, dan jumlah bakteri hidup yang tersisa ditentukan setiap 24 jam. Setelah 5 hari, biofilm diinokulasi ulang dengan 3,85×10⁵ Staphylococcus aureus atau 1,22×10⁵ P. Koloni bakterioplankton Pseudomonas aeruginosa dibentuk secara individual untuk menilai pemulihan biofilm. Grafik menunjukkan rata-rata +/- kesalahan standar.
Untuk memvisualisasikan efek balutan perak pada viabilitas biofilm, balutan diaplikasikan pada biofilm matang yang tumbuh pada kulit babi ex vivo. Setelah 24 jam, balutan dilepas dan biofilm diwarnai dengan pewarna reaktif biru, yang dimetabolisme oleh bakteri hidup menjadi warna merah muda. Biofilm yang diberi balutan kontrol berwarna merah muda, menunjukkan adanya bakteri hidup di dalam biofilm (Gambar 2A). Sebaliknya, biofilm yang diberi balutan Ag oxysol sebagian besar berwarna biru, menunjukkan bahwa bakteri yang tersisa di permukaan kulit babi adalah bakteri yang tidak hidup (Gambar 2B). Pewarnaan campuran biru dan merah muda diamati pada biofilm yang diberi balutan yang mengandung Ag1+, menunjukkan adanya bakteri hidup dan tidak hidup di dalam biofilm (Gambar 2C), sedangkan balutan EDTA/BC yang mengandung Ag1+ sebagian besar berwarna biru dengan beberapa bintik merah muda, menunjukkan area yang tidak terpengaruh oleh balutan perak (Gambar 2D). Kuantifikasi area aktif (merah muda) dan tidak aktif (biru) menunjukkan bahwa patch kontrol aktif sebesar 75% (Gambar 2E). Balutan Ag1+ + EDTA/BC menunjukkan kinerja yang serupa dengan balutan garam Ag teroksigenasi, dengan tingkat kelangsungan hidup masing-masing 13% dan 14%. Balutan Ag1+ juga mengurangi viabilitas bakteri sebesar 21%. Biofilm ini kemudian diamati menggunakan mikroskop elektron pemindaian (SEM). Setelah perawatan dengan balutan kontrol dan balutan Ag1+, lapisan Pseudomonas aeruginosa terlihat menutupi kulit babi (Gambar 2F,H), sedangkan setelah perawatan dengan balutan Ag1+, hanya sedikit sel bakteri yang ditemukan dan sedikit sel bakteri yang ditemukan di bawahnya. Serat kolagen dapat dianggap sebagai struktur jaringan kulit babi (Gambar 2G). Setelah perawatan dengan balutan Ag1+ + EDTA/BC, plak bakteri dan plak serat kolagen di bawahnya terlihat (Gambar 2I).
Visualisasi biofilm Pseudomonas aeruginosa setelah perawatan dengan balutan perak. (A–D) Viabilitas bakteri dalam biofilm Pseudomonas aeruginosa yang tumbuh pada kulit babi divisualisasikan menggunakan pewarna viabilitas PrestoBlue 24 jam setelah perawatan dengan balutan perak atau balutan kontrol non-antimikroba. Bakteri hidup berwarna merah muda, bakteri yang tidak hidup dan kulit babi berwarna biru. (E) Kuantifikasi biofilm Pseudomonas aeruginosa yang tumbuh pada kulit babi (titik merah muda) menggunakan mikroskop elektron pemindaian Image Pro versi 10 (FI) dan dirawat dengan balutan perak atau balutan kontrol non-antimikroba selama 24 jam. Skala bar SEM = 5 µm. (J–M) Biofilm koloni tumbuh pada filter dan diwarnai dengan pewarna reaktif PrestoBlue setelah inkubasi 24 jam dengan balutan perak.
Untuk menentukan apakah kontak dekat antara perban dan biofilm memengaruhi efektivitas perban, biofilm kolonial yang ditempatkan pada permukaan datar diberi perban selama 24 jam dan kemudian diwarnai dengan pewarna reaktif. Biofilm yang tidak diberi perban berwarna merah muda gelap (Gambar 2J). Berbeda dengan biofilm yang diberi perban yang mengandung garam Ag teroksigenasi (Gambar 2K), biofilm yang diberi perban yang mengandung Ag1+ atau Ag1+ + EDTA/BC menunjukkan pita pewarnaan merah muda (Gambar 2L,M). Pewarnaan merah muda ini menunjukkan adanya bakteri yang hidup dan terkait dengan area jahitan di dalam perban. Area yang dijahit ini menciptakan ruang mati yang memungkinkan bakteri di dalam biofilm untuk bertahan hidup.
Untuk mengevaluasi efektivitas balutan perak secara in vivo, luka sayatan setebal penuh pada tikus yang terinfeksi biofilm S. aureus dan P. aeruginosa dewasa diobati dengan balutan kontrol non-antimikroba atau balutan perak. Setelah 3 hari perawatan, analisis citra makroskopis menunjukkan ukuran luka yang lebih kecil ketika diobati dengan balutan garam beroksigen dibandingkan dengan balutan kontrol non-antimikroba dan balutan perak lainnya (Gambar 3A-H). Untuk mengkonfirmasi pengamatan ini, luka diambil dan luas luka serta reepitelisasi diukur pada potongan jaringan yang diwarnai hematoksilin dan eosin menggunakan perangkat lunak Image Pro versi 10 (Gambar 3I-L).
Pengaruh balutan perak pada permukaan luka dan re-epitelisasi luka yang terinfeksi biofilm. (A–H) Sel-sel kecil yang terinfeksi biofilm Pseudomonas aeruginosa (A–D) dan Staphylococcus aureus (E–H) setelah tiga hari perawatan dengan balutan kontrol non-antimikroba, balutan garam Ag teroksigenasi, balutan Ag1+, dan balutan Ag1+. Gambar makroskopik representatif. Luka pada tikus dengan balutan Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Infeksi Pseudomonas aeruginosa representatif, penampang histologis yang diwarnai dengan hematoksilin dan eosin, digunakan untuk mengukur luas luka dan regenerasi epitel. Kuantifikasi luas luka (M, O) dan persentase re-epitelisasi (N, P) luka yang terinfeksi biofilm Pseudomonas aeruginosa (M, N) dan Staphylococcus aureus (O, P) (per kelompok perlakuan n = 12). Grafik menunjukkan rata-rata +/- kesalahan standar. * berarti p = < 0,05 ** berarti p = < 0,01; Skala makroskopik = 2,5 mm, skala histologis = 500 µm.
Kuantifikasi luas luka pada luka yang terinfeksi biofilm Pseudomonas aeruginosa (Gambar 3M) menunjukkan bahwa luka yang diobati dengan garam oksida Ag memiliki ukuran luka rata-rata 2,5 mm2, sedangkan balutan kontrol non-antimikroba memiliki ukuran luka rata-rata 3,1 mm2, yang tidak mencapai signifikansi statistik (Gambar 3M). p = 0,423). Luka yang diobati dengan Ag1+ atau Ag1+ + EDTA/BC tidak menunjukkan pengurangan luas luka (masing-masing 3,1 mm2 dan 3,6 mm2). Perawatan dengan balutan garam Ag teroksigenasi mendorong re-epitelisasi lebih besar daripada balutan kontrol non-antimikroba (masing-masing 34% dan 15%; p = 0,029) dan Ag1+ atau Ag1+ + EDTA/BC (masing-masing 10% dan 11%) (Gambar 3N).
Tren serupa pada luas luka dan regenerasi epitel diamati pada luka yang terinfeksi biofilm S. aureus (Gambar 3O). Balutan yang mengandung garam perak teroksigenasi mengurangi luas luka (2,0 mm2) sebesar 23% dibandingkan dengan balutan kontrol non-antimikroba (2,6 mm2), meskipun pengurangan ini tidak signifikan (p = 0,304) (Gambar 3O). Selain itu, luas luka pada kelompok perlakuan Ag1+ sedikit berkurang (2,4 mm2), sedangkan luka yang diobati dengan balutan Ag1+ + EDTA/BC tidak mengurangi luas luka (2,9 mm2). Garam oksigen Ag juga mendorong re-epitelisasi luka yang terinfeksi biofilm S. aureus (31%) hingga tingkat yang lebih besar daripada yang diobati dengan balutan kontrol non-antimikroba (12%, p = 0,003) (Gambar 3P). Pembalut Ag1+ (16%, p = 0,903) dan pembalut Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) menunjukkan tingkat regenerasi epitel yang mirip dengan kontrol.
Untuk memvisualisasikan efek balutan perak pada matriks biofilm, pewarnaan iodida Toto 1 dan Syto 60 dilakukan (Gambar 4). Iodida Toto 1 adalah pewarna yang tidak dapat menembus sel yang dapat digunakan untuk memvisualisasikan secara akurat asam nukleat ekstraseluler, yang melimpah dalam EPS biofilm. Syto 60 adalah pewarna yang dapat menembus sel yang digunakan sebagai pewarna kontras16. Pengamatan iodida Toto 1 dan Syto 60 pada luka yang diinokulasi dengan biofilm Pseudomonas aeruginosa (Gambar 4A-D) dan Staphylococcus aureus (Gambar 4I-L) menunjukkan bahwa setelah 3 hari perawatan balutan, EPS dalam biofilm berkurang secara signifikan. Balutan yang mengandung garam teroksigenasi Ag dan Ag1+ + EDTA/BC. Balutan Ag1+ tanpa komponen antibiofilm tambahan secara signifikan mengurangi DNA bebas sel pada luka yang diinokulasi dengan Pseudomonas aeruginosa tetapi kurang efektif pada luka yang diinokulasi dengan Staphylococcus aureus.
Pencitraan in vivo biofilm luka setelah 3 hari perawatan dengan kontrol atau perban perak. Gambar konfokal Pseudomonas aeruginosa (A–D) dan Staphylococcus aureus (I–L) yang diwarnai dengan Toto 1 (hijau) untuk memvisualisasikan asam nukleat ekstraseluler, komponen polimer biofilm ekstraseluler. Untuk mewarnai asam nukleat intraseluler, gunakan Syto 60 (merah). Mikroskop elektron pemindaian luka yang terinfeksi biofilm Pseudomonas aeruginosa (E–H) dan Staphylococcus aureus (M–P) setelah 3 hari perawatan dengan kontrol dan perban perak. Skala bar SEM = 5 µm. Skala bar pencitraan konfokal = 50 µm.
Mikroskop elektron pemindaian menunjukkan bahwa tikus yang diinokulasi dengan koloni biofilm Pseudomonas aeruginosa (Gambar 4E-H) dan Staphylococcus aureus (Gambar 4M-P) memiliki bakteri yang jauh lebih sedikit di luka mereka setelah 3 hari perawatan dengan semua perban perak.
Untuk mengevaluasi efek balutan perak pada peradangan luka pada tikus yang terinfeksi biofilm, potongan luka yang terinfeksi biofilm yang diobati dengan balutan kontrol atau balutan perak selama 3 hari diwarnai secara imunohistokimia menggunakan antibodi spesifik untuk neutrofil dan makrofag. Penentuan kuantitatif neutrofil dan makrofag secara internal. jaringan granulasi. Gambar 5). Semua balutan perak mengurangi jumlah neutrofil dan makrofag pada luka yang terinfeksi Pseudomonas aeruginosa dibandingkan dengan balutan kontrol non-antimikroba setelah tiga hari pengobatan. Namun, pengobatan dengan balutan garam perak teroksigenasi menghasilkan pengurangan neutrofil (p = <0,0001) dan makrofag (p = <0,0001) yang lebih besar dibandingkan dengan balutan perak lain yang diuji (Gambar 5I,J). Meskipun Ag1+ + EDTA/BC memiliki efek yang lebih besar pada biofilm luka, ia mengurangi kadar neutrofil dan makrofag hingga tingkat yang lebih rendah daripada balutan Ag1+. Luka sedang yang terinfeksi biofilm S. aureus juga diamati setelah pembalutan dengan Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) dan Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) oxisol dibandingkan dengan kontrol. Tren serupa diamati untuk neutropenia. pembalutan (Gambar 5K). Namun, hanya pembalutan garam Ag yang dioksigenasi yang menunjukkan pengurangan signifikan jumlah makrofag dalam jaringan granulasi dibandingkan dengan kontrol pada luka yang terinfeksi biofilm S. aureus (p = 0,0339) (Gambar 5L).
Neutrofil dan makrofag diukur pada luka yang terinfeksi biofilm Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus setelah 3 hari perawatan dengan kontrol non-antimikroba atau perban perak. Neutrofil (AD) dan makrofag (EH) diukur pada potongan jaringan yang diwarnai dengan antibodi spesifik untuk neutrofil atau makrofag. Kuantifikasi neutrofil (I dan K) dan makrofag (J dan L) pada luka yang terinfeksi biofilm Pseudomonas aeruginosa (I dan J) dan Staphylococcus aureus (K & L). N = 12 per kelompok. Grafik menunjukkan nilai rata-rata +/- kesalahan standar, nilai signifikansi dibandingkan dengan perban kontrol non-antibakteri, * berarti p = < 0,05, ** berarti p = < 0,01; *** berarti p = < 0,001; menunjukkan p = <0,0001).
Kemudian, kami menilai efek balutan perak pada penyembuhan yang tidak bergantung pada infeksi. Luka eksisi yang tidak terinfeksi diobati dengan balutan kontrol non-antimikroba atau balutan perak selama 3 hari (Gambar 6). Di antara balutan perak yang diuji, hanya luka yang diobati dengan balutan garam teroksigenasi yang tampak lebih kecil pada gambar makroskopis dibandingkan luka yang diobati dengan kontrol (Gambar 6A-D). Kuantifikasi luas luka menggunakan analisis histologis menunjukkan bahwa luas luka rata-rata setelah perawatan dengan balutan Ag oxysols adalah 2,35 mm2 dibandingkan dengan 2,96 mm2 untuk luka yang diobati dengan kelompok kontrol, tetapi perbedaan ini tidak mencapai signifikansi statistik (p = 0,488) (Gambar 6I). Sebaliknya, tidak ada pengurangan luas luka yang diamati setelah perawatan dengan balutan Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) atau Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) dibandingkan dengan kelompok kontrol. Peningkatan regenerasi epitel diamati dengan balutan Ag oxysol dibandingkan dengan kelompok kontrol (30% vs. 22%, masing-masing), meskipun ini tidak mencapai signifikansi (p = 0,067), ini cukup signifikan dan mengkonfirmasi hasil sebelumnya. Balutan dengan oxysol mendorong re-epitelisasi. -Epitelisasi luka yang tidak terinfeksi17. Sebaliknya, pengobatan dengan balutan Ag1+ atau Ag1+ + EDTA/BC tidak berpengaruh atau menunjukkan penurunan re-epitelisasi dibandingkan dengan kontrol.
Pengaruh balutan luka perak terhadap penyembuhan luka pada tikus yang tidak terinfeksi dengan reseksi lengkap. (AD) Gambar makroskopik representatif dari luka setelah tiga hari perawatan dengan balutan kontrol non-antimikroba dan balutan perak. (EH) Potongan luka representatif yang diwarnai dengan hematoksilin dan eosin. Kuantifikasi luas luka (I) dan persentase reepitelisasi (J) dihitung dari potongan histologis di titik tengah luka menggunakan perangkat lunak analisis gambar (n = 11–12 per kelompok perlakuan). Grafik menunjukkan rata-rata +/- kesalahan standar. * berarti p = <0,05.
Perak memiliki sejarah panjang penggunaan sebagai terapi antimikroba dalam penyembuhan luka, tetapi berbagai formulasi dan metode pemberian yang berbeda dapat menyebabkan perbedaan efektivitas antimikroba 18. Selain itu, sifat antibiofilm dari sistem pemberian perak tertentu belum sepenuhnya dipahami. Meskipun respons imun inang relatif efektif terhadap bakteri planktonik, umumnya kurang efektif terhadap biofilm19. Bakteri planktonik mudah difagositosis oleh makrofag, tetapi di dalam biofilm, sel-sel yang teragregasi menimbulkan masalah tambahan dengan membatasi respons inang hingga sel-sel imun dapat mengalami apoptosis dan melepaskan faktor proinflamasi untuk meningkatkan respons imun20. Telah diamati bahwa beberapa leukosit dapat menembus biofilm21 tetapi tidak mampu memfagositosis bakteri setelah pertahanan ini terganggu22. Pendekatan holistik harus digunakan untuk mendukung respons imun inang terhadap infeksi biofilm luka. Debridemen luka dapat secara fisik mengganggu biofilm dan menghilangkan sebagian besar beban biologis, tetapi respons imun inang mungkin tidak efektif terhadap biofilm yang tersisa, terutama jika respons imun inang terganggu. Dengan demikian, terapi antimikroba seperti perban perak dapat mendukung respons imun tubuh dan menghilangkan infeksi biofilm. Komposisi, konsentrasi, kelarutan, dan substrat pengantaran dapat memengaruhi efektivitas antimikroba perak. Dalam beberapa tahun terakhir, kemajuan dalam teknologi pengolahan perak telah membuat perban ini lebih efektif9,23. Seiring kemajuan teknologi perban perak, penting untuk memahami efektivitas perban ini dalam mengendalikan infeksi luka dan, yang lebih penting, dampak bentuk perak yang ampuh ini pada lingkungan luka dan penyembuhan.
Dalam penelitian ini, kami membandingkan efektivitas dua perban perak canggih dengan perban perak konvensional yang menghasilkan ion Ag1+ terhadap biofilm menggunakan berbagai model in vitro dan in vivo. Kami juga menilai efek perban ini pada lingkungan luka dan penyembuhan yang tidak bergantung pada infeksi. Untuk meminimalkan pengaruh matriks pengantar, semua perban perak yang diuji terbuat dari karboksimetilselulosa.
Evaluasi awal kami terhadap perban perak ini terhadap biofilm kolonial Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus menunjukkan bahwa, tidak seperti perban Ag1+ tradisional, dua perban perak canggih, Ag1+ + EDTA/BC dan garam Ag teroksigenasi, efektif membunuh bakteri biofilm dalam beberapa hari. Selain itu, perban ini mencegah pembentukan kembali biofilm setelah paparan berulang terhadap bakteri planktonik. Perban Ag1+ mengandung perak klorida, senyawa perak dan matriks dasar yang sama dengan Ag1+ + EDTA/BC, dan memiliki efek terbatas pada viabilitas bakteri dalam biofilm selama periode yang sama. Pengamatan bahwa perban Ag1+ + EDTA/BC lebih efektif melawan biofilm daripada perban Ag1+ yang terdiri dari matriks dan senyawa perak yang sama mendukung gagasan bahwa bahan tambahan diperlukan untuk meningkatkan efektivitas perak klorida terhadap biofilm, seperti yang telah dilaporkan di tempat lain15. Hasil ini mendukung gagasan bahwa BC dan EDTA memainkan peran tambahan yang berkontribusi pada efektivitas balutan secara keseluruhan dan bahwa tidak adanya komponen ini dalam balutan Ag1+ mungkin telah berkontribusi pada kegagalan untuk menunjukkan kemanjuran in vitro. Kami menemukan bahwa balutan garam Ag teroksigenasi yang menghasilkan ion Ag2+ dan Ag3+ menunjukkan kemanjuran antibakteri yang lebih kuat daripada Ag1+ dan pada tingkat yang mirip dengan Ag1+ + EDTA/BC. Namun, karena potensi redoks yang tinggi, tidak jelas berapa lama ion Ag3+ tetap aktif dan efektif terhadap biofilm luka dan oleh karena itu perlu diteliti lebih lanjut. Selain itu, ada banyak balutan berbeda yang menghasilkan ion Ag1+ yang tidak diuji dalam penelitian ini. Balutan ini terdiri dari senyawa perak, konsentrasi, dan matriks dasar yang berbeda, yang dapat memengaruhi pengiriman ion Ag1+ dan efektivitasnya terhadap biofilm. Perlu juga dicatat bahwa ada banyak model in vitro dan in vivo yang berbeda yang digunakan untuk mengevaluasi efektivitas balutan luka terhadap biofilm. Jenis model yang digunakan, serta kandungan garam dan protein dalam media yang digunakan pada model tersebut, akan memengaruhi efektivitas balutan. Dalam model in vivo kami, kami membiarkan biofilm matang secara in vitro dan kemudian memindahkannya ke permukaan kulit luka. Respons imun tikus inang relatif efektif terhadap bakteri planktonik yang diaplikasikan pada luka, sehingga membentuk biofilm saat luka sembuh. Penambahan biofilm matang pada luka membatasi efektivitas respons imun inang terhadap pembentukan biofilm dengan memungkinkan biofilm matang untuk menetap di dalam luka sebelum penyembuhan dapat dimulai. Dengan demikian, model kami memungkinkan kami untuk mengevaluasi efektivitas balutan antimikroba pada biofilm matang sebelum luka mulai sembuh.
Kami juga menemukan bahwa kesesuaian balutan memengaruhi efektivitas balutan perak pada biofilm yang ditumbuhkan secara in vitro dan kulit babi. Kontak dekat dengan luka dianggap penting untuk efektivitas antimikroba balutan24,25. Balutan yang mengandung garam Ag teroksigenasi berada dalam kontak dekat dengan biofilm yang matang, menghasilkan pengurangan signifikan jumlah bakteri hidup di dalam biofilm setelah 24 jam. Sebaliknya, ketika diobati dengan balutan Ag1+ dan Ag1+ + EDTA/BC, sejumlah besar bakteri hidup tetap ada. Balutan ini mengandung jahitan di sepanjang balutan, yang menciptakan ruang mati yang mencegah kontak dekat dengan biofilm. Dalam studi in vitro kami, area yang tidak bersentuhan ini mencegah pembunuhan bakteri hidup di dalam biofilm. Kami menilai viabilitas bakteri hanya setelah 24 jam perawatan; Seiring waktu, saat balutan menjadi lebih jenuh, mungkin ada lebih sedikit ruang mati, mengurangi area untuk bakteri hidup ini. Namun, ini menyoroti pentingnya komposisi balutan, bukan hanya jenis perak dalam balutan.
Meskipun studi in vitro berguna untuk membandingkan efektivitas berbagai teknologi perak, penting juga untuk memahami efek balutan ini pada biofilm in vivo, di mana jaringan inang dan respons imun berkontribusi pada efektivitas balutan terhadap biofilm. Efek balutan ini pada biofilm luka diamati menggunakan mikroskop elektron pemindaian dan pewarnaan EPS pada biofilm menggunakan pewarna DNA intraseluler dan ekstraseluler. Kami menemukan bahwa setelah 3 hari perawatan, semua balutan efektif dalam mengurangi DNA bebas sel pada luka yang terinfeksi biofilm, tetapi balutan Ag1+ kurang efektif pada luka yang terinfeksi Staphylococcus aureus. Mikroskop elektron pemindaian juga menunjukkan bahwa bakteri yang hadir pada luka yang diobati dengan balutan perak jauh lebih sedikit, meskipun hal ini lebih jelas terlihat pada balutan garam Ag teroksigenasi dan balutan Ag1+ + EDTA/BC dibandingkan dengan balutan Ag1+. Data ini menunjukkan bahwa perban perak yang diuji memiliki tingkat dampak yang bervariasi pada struktur biofilm, tetapi tidak satu pun dari perban perak tersebut mampu memberantas biofilm, yang mendukung perlunya pendekatan holistik untuk pengobatan infeksi biofilm luka; penggunaan perban perak. Pengobatan didahului oleh debridemen fisik untuk menghilangkan sebagian besar biofilm.
Luka kronis seringkali berada dalam kondisi peradangan parah, dengan sel-sel inflamasi berlebih yang tetap berada di jaringan luka dalam jangka waktu lama, menyebabkan kerusakan jaringan dan mengurangi oksigen yang dibutuhkan untuk metabolisme dan fungsi seluler yang efisien di dalam luka26. Biofilm memperburuk lingkungan luka yang tidak menguntungkan ini dengan memengaruhi penyembuhan secara negatif dalam berbagai cara, termasuk penghambatan proliferasi dan migrasi sel serta aktivasi sitokin proinflamasi27. Seiring dengan semakin efektifnya perban perak, penting untuk memahami dampaknya terhadap lingkungan luka dan penyembuhan.
Menariknya, meskipun semua perban perak mempengaruhi komposisi biofilm, hanya perban garam perak teroksigenasi yang meningkatkan re-epitelisasi luka yang terinfeksi ini. Data ini mendukung temuan kami sebelumnya17 dan temuan Kalan et al. (2017)28, yang menunjukkan profil keamanan dan toksisitas yang baik dari garam perak teroksigenasi, karena konsentrasi perak yang lebih rendah efektif melawan biofilm.
Studi kami saat ini menyoroti perbedaan teknologi perak antara perban perak antimikroba dan dampak teknologi ini pada lingkungan luka dan penyembuhan yang tidak bergantung pada infeksi. Namun, hasil ini berbeda dari studi sebelumnya yang menunjukkan bahwa perban Ag1+ + EDTA/BC meningkatkan parameter penyembuhan telinga kelinci yang terluka secara in vivo. Namun, hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan model hewan, waktu pengukuran, dan metode aplikasi bakteri29. Dalam kasus ini, pengukuran luka dilakukan 12 hari setelah cedera untuk memungkinkan bahan aktif perban bekerja pada biofilm dalam jangka waktu yang lebih lama. Hal ini didukung oleh sebuah studi yang menunjukkan bahwa ulkus kaki yang terinfeksi secara klinis yang diobati dengan Ag1+ + EDTA/BC awalnya membesar setelah satu minggu pengobatan, dan kemudian selama 3 minggu pengobatan berikutnya dengan Ag1+ + EDTA/BC dan dalam 4 minggu penggunaan obat non-antimikroba. Perban CMC mengurangi ukuran ulkus30.
Beberapa bentuk dan konsentrasi perak sebelumnya telah terbukti bersifat sitotoksik secara in vitro 11, tetapi hasil in vitro ini tidak selalu diterjemahkan menjadi efek samping secara in vivo. Selain itu, kemajuan dalam teknologi perak dan pemahaman yang lebih baik tentang senyawa dan konsentrasi perak dalam perban telah menyebabkan pengembangan banyak perban perak yang aman dan efektif. Namun, seiring kemajuan teknologi perban perak, penting untuk memahami dampak perban ini pada lingkungan luka31,32,33. Sebelumnya dilaporkan bahwa peningkatan laju re-epitelisasi sesuai dengan peningkatan proporsi makrofag M2 anti-inflamasi dibandingkan dengan fenotipe M1 pro-inflamasi. Hal ini dicatat dalam model tikus sebelumnya di mana perban luka hidrogel perak dibandingkan dengan perak sulfadiazine dan hidrogel non-antimikroba34.
Luka kronis dapat menunjukkan peradangan yang berlebihan dan telah diamati bahwa keberadaan neutrofil berlebih dapat merugikan penyembuhan luka35. Dalam sebuah penelitian pada tikus yang kekurangan neutrofil, keberadaan neutrofil menunda reepitelisasi. Keberadaan neutrofil berlebih menyebabkan tingginya kadar protease dan spesies oksigen reaktif, seperti superoksida dan hidrogen peroksida, yang dikaitkan dengan luka kronis dan penyembuhan yang lambat37,38. Demikian pula, peningkatan jumlah makrofag, jika tidak terkontrol, dapat menyebabkan keterlambatan penyembuhan luka39. Peningkatan ini sangat penting jika makrofag tidak mampu bertransisi dari fenotipe pro-inflamasi ke fenotipe pro-penyembuhan, sehingga luka gagal keluar dari fase inflamasi penyembuhan40. Kami mengamati penurunan neutrofil dan makrofag pada luka yang terinfeksi biofilm setelah 3 hari perawatan dengan semua balutan perak, tetapi penurunan tersebut lebih nyata dengan balutan garam beroksigen. Penurunan ini mungkin merupakan hasil langsung dari respons imun terhadap perak, respons terhadap penurunan beban mikroba, atau luka berada pada tahap penyembuhan yang lebih lanjut sehingga sel-sel imun di dalam luka berkurang. Mengurangi jumlah sel inflamasi di dalam luka dapat mempertahankan lingkungan yang kondusif untuk penyembuhan luka. Mekanisme kerja bagaimana garam oksida Ag mendorong penyembuhan yang tidak bergantung pada infeksi masih belum jelas, tetapi kemampuan garam oksida Ag untuk menghasilkan oksigen dan menghancurkan kadar hidrogen peroksida yang berbahaya, suatu mediator peradangan, dapat menjelaskan hal ini dan memerlukan penelitian lebih lanjut17.
Luka infeksi kronis yang tidak kunjung sembuh menimbulkan masalah bagi dokter dan pasien. Meskipun banyak perban mengklaim efektivitas antimikroba, penelitian jarang berfokus pada faktor-faktor kunci lain yang memengaruhi lingkungan mikro luka. Studi ini menunjukkan bahwa teknologi perak yang berbeda memiliki efektivitas antimikroba yang berbeda dan, yang penting, efek yang berbeda pada lingkungan luka dan penyembuhan, terlepas dari infeksi. Meskipun studi in vitro dan in vivo ini menunjukkan efektivitas perban ini dalam mengobati infeksi luka dan mempercepat penyembuhan, uji coba terkontrol secara acak diperlukan untuk mengevaluasi efektivitas perban ini di klinik.
Kumpulan data yang digunakan dan/atau dianalisis selama penelitian ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
Waktu posting: 15 Juli 2024