Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS terbatas. Untuk hasil terbaik, kami sarankan menggunakan browser yang lebih baru (atau menonaktifkan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan javascript.
Pembentukan model hewan perubahan modik (MC) adalah dasar penting untuk mempelajari MC. Lima puluh empat kelinci putih Selandia Baru dibagi menjadi kelompok operasi palsu, kelompok implantasi otot (kelompok ME) dan kelompok implantasi nukleus pulposus (kelompok NPE). Pada kelompok NPE, cakram intervertebralis diekspos oleh pendekatan bedah lumbar anterolateral dan jarum digunakan untuk menusuk tubuh vertebral L5 di dekat pelat ujung. NP diekstraksi dari cakram intervertebral L1/2 oleh jarum suntik dan disuntikkan ke dalamnya. Mengebor lubang di tulang subchondral. Prosedur bedah dan metode pengeboran pada kelompok implantasi otot dan kelompok operasi palsu sama dengan yang ada dalam kelompok implantasi NP. Pada kelompok ME, sepotong otot ditempatkan di dalam lubang, sementara di kelompok operasi palsu, tidak ada yang ditempatkan di dalam lubang. Setelah operasi, pemindaian MRI dan pengujian biologis molekuler dilakukan. Sinyal dalam kelompok NPE berubah, tetapi tidak ada perubahan sinyal yang jelas pada kelompok operasi palsu dan kelompok ME. Pengamatan histologis menunjukkan bahwa proliferasi jaringan abnormal diamati di lokasi implantasi, dan ekspresi IL-4, IL-17 dan IFN-γ meningkat pada kelompok NPE. Implantasi NP ke dalam tulang subkondral dapat membentuk model hewan MC.
Perubahan modik (MC) adalah lesi dari pelat akhir vertebral dan sumsum tulang yang berdekatan yang terlihat pada magnetic resonance imaging (MRI). Mereka cukup umum pada individu dengan gejala terkait1. Banyak penelitian telah menekankan pentingnya MC karena hubungannya dengan nyeri punggung bawah (LBP) 2,3. De Roos et al.4 dan Modic et al.5 secara independen pertama kali menggambarkan tiga jenis kelainan sinyal subkondral yang berbeda di sumsum tulang vertebral. Perubahan tipe I modik adalah hypointense pada urutan T1-weighted (T1W) dan hyperintense pada urutan T2-weighted (T2W). Lesi ini mengungkapkan fissure endplate dan jaringan granulasi vaskular yang berdekatan di sumsum tulang. Perubahan tipe II modik menunjukkan sinyal tinggi pada urutan T1W dan T2W. Dalam jenis lesi ini, penghancuran endplate dapat ditemukan, serta penggantian lemak histologis dari sumsum tulang yang berdekatan. Perubahan tipe III modik menunjukkan sinyal rendah dalam urutan T1W dan T2W. Lesi sklerotik yang sesuai dengan pelat akhir telah diamati6. MC dianggap sebagai penyakit patologis tulang belakang dan terkait erat dengan banyak penyakit degeneratif dari tulang belakang7,8,9.
Mempertimbangkan data yang tersedia, beberapa penelitian telah memberikan wawasan terperinci tentang etiologi dan mekanisme patologis MC. Albert et al. menyarankan bahwa MC mungkin disebabkan oleh herniasi disk. Hu et al. MC yang dikaitkan dengan degenerasi disk yang parah10. KROC mengusulkan konsep "pecahnya cakram internal," yang menyatakan bahwa trauma cakram berulang dapat menyebabkan mikrotear di pelat akhir. Setelah pembentukan sumbing, penghancuran endplate oleh nukleus pulposus (NP) dapat memicu respons autoimun, yang selanjutnya mengarah pada pengembangan MC11. Ma et al. Berbagi pandangan yang sama dan melaporkan bahwa autoimunitas yang diinduksi NP memainkan peran kunci dalam patogenesis MC12.
Sel -sel sistem kekebalan tubuh, terutama limfosit helper CD4+ T, memainkan peran penting dalam patogenesis autoimunitas13. Subset Th17 yang baru ditemukan menghasilkan sitokin IL-17 proinflamasi, mempromosikan ekspresi kemokin, dan merangsang sel T dalam organ yang rusak untuk menghasilkan IFN-γ14. Sel Th2 juga memainkan peran unik dalam patogenesis respons imun. Ekspresi IL-4 sebagai sel Th2 yang representatif dapat menyebabkan konsekuensi imunopatologis yang parah15.
Meskipun banyak studi klinis telah dilakukan pada MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, masih ada kekurangan model eksperimental hewan yang cocok yang dapat meniru proses MC yang sering terjadi pada manusia dan bisa Digunakan untuk menyelidiki etiologi atau perawatan baru seperti terapi yang ditargetkan. Sampai saat ini, hanya beberapa model hewan MC yang dilaporkan mempelajari mekanisme patologis yang mendasarinya.
Berdasarkan teori autoimun yang diusulkan oleh Albert dan MA, penelitian ini menetapkan model MC kelinci yang sederhana dan dapat direproduksi dengan autotransplanting NP di dekat pelat ujung vertebral yang dibor. Tujuan lain adalah untuk mengamati karakteristik histologis model hewan dan mengevaluasi mekanisme spesifik NP dalam pengembangan MC. Untuk tujuan ini, kami menggunakan teknik seperti biologi molekuler, MRI, dan studi histologis untuk mempelajari perkembangan MC.
Dua kelinci meninggal karena pendarahan selama operasi, dan empat kelinci meninggal selama anestesi selama MRI. 48 kelinci yang tersisa bertahan dan tidak menunjukkan tanda -tanda perilaku atau neurologis setelah operasi.
MRI menunjukkan bahwa intensitas sinyal jaringan tertanam di lubang yang berbeda berbeda. Intensitas sinyal tubuh vertebral L5 pada kelompok NPE secara bertahap berubah pada 12, 16 dan 20 minggu setelah penyisipan (urutan T1W menunjukkan sinyal rendah, dan urutan T2W menunjukkan sinyal campuran ditambah sinyal rendah) (Gbr. 1C), sedangkan penampilan MRI Dari dua kelompok lain dari bagian tertanam tetap relatif stabil selama periode yang sama (Gbr. 1A, b).
(A) MRI sekuensial representatif dari tulang belakang lumbar kelinci pada 3 titik waktu. Tidak ada kelainan sinyal yang ditemukan dalam gambar kelompok operasi palsu. (B) Karakteristik sinyal dari tubuh vertebral pada kelompok ME mirip dengan yang ada di kelompok operasi palsu, dan tidak ada perubahan sinyal yang signifikan yang diamati di situs embedding dari waktu ke waktu. (C) Pada kelompok NPE, sinyal rendah terlihat jelas dalam urutan T1W, dan sinyal campuran dan sinyal rendah terlihat jelas dalam urutan T2W. Dari periode 12 minggu hingga periode 20 minggu, sinyal tinggi sporadis di sekitar sinyal rendah dalam urutan T2W berkurang.
Hiperplasia tulang yang jelas dapat dilihat di tempat implantasi tubuh vertebra pada kelompok NPE, dan hiperplasia tulang terjadi lebih cepat dari 12 hingga 20 minggu (Gbr. 2C) dibandingkan dengan kelompok NPE, tidak ada perubahan signifikan yang diamati pada vertebral yang dimodelkan dengan model vertebral yang dimodelkan dengan model yang dimodelkan dengan model vertebral yang dimodelkan dengan model yang dimodelkan dengan model vertebral yang dimodelkan dengan model yang dimodelkan dengan model yang dimodelkan dengan model model tubuh; Sham Group dan ME Group (Gbr. 2C) 2A, B).
(A) Permukaan tubuh vertebral pada bagian yang ditanamkan sangat halus, lubangnya sembuh dengan baik, dan tidak ada hiperplasia di tubuh vertebral. (B) Bentuk situs yang ditanamkan dalam kelompok ME mirip dengan yang ada di kelompok operasi palsu, dan tidak ada perubahan yang jelas dalam penampilan situs yang ditanamkan dari waktu ke waktu. (C) Hiperplasia tulang terjadi di lokasi yang ditanamkan pada kelompok NPE. Hiperplasia tulang meningkat dengan cepat dan bahkan diperpanjang melalui cakram intervertebralis ke tubuh vertebral kontralateral.
Analisis histologis memberikan informasi yang lebih rinci tentang pembentukan tulang. Gambar 3 menunjukkan foto -foto bagian pasca operasi yang diwarnai dengan H&E. Pada kelompok operasi palsu, kondrosit diatur dengan baik dan tidak ada proliferasi sel yang terdeteksi (Gbr. 3A). Situasi dalam kelompok ME mirip dengan yang terjadi pada kelompok operasi palsu (Gbr. 3B). Namun, pada kelompok NPE, sejumlah besar kondrosit dan proliferasi sel seperti NP diamati di lokasi implantasi (Gbr. 3C);
(A) Trabecula dapat dilihat di dekat pelat ujung, kondrosit diatur dengan rapi dengan ukuran dan bentuk sel yang seragam dan tidak ada proliferasi (40 kali). (B) Kondisi situs implantasi dalam kelompok ME mirip dengan kelompok Sham. Trabecula dan kondrosit dapat dilihat, tetapi tidak ada proliferasi yang jelas di lokasi implantasi (40 kali). (B) Dapat dilihat bahwa kondrosit dan sel seperti NP berkembang biak secara signifikan, dan bentuk dan ukuran kondrosit tidak rata (40 kali).
Ekspresi interleukin 4 (IL-4) mRNA, interleukin 17 (IL-17) mRNA, dan interferon γ (IFN-γ) mRNA diamati pada kelompok NPE dan ME. Ketika tingkat ekspresi gen target dibandingkan, ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ meningkat secara signifikan pada kelompok NPE dibandingkan dengan kelompok ME dan kelompok operasi palsu (Gbr. 4) (P <0,05). Dibandingkan dengan kelompok operasi palsu, tingkat ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ pada kelompok ME meningkat hanya sedikit dan tidak mencapai perubahan statistik (p> 0,05).
Ekspresi mRNA IL-4, IL-17 dan IFN-γ pada kelompok NPE menunjukkan tren yang jauh lebih tinggi daripada yang ada dalam kelompok operasi palsu dan kelompok ME (p <0,05).
Sebaliknya, tingkat ekspresi dalam kelompok ME tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p> 0,05).
Analisis Western blot dilakukan dengan menggunakan antibodi yang tersedia secara komersial terhadap IL-4 dan IL-17 untuk mengkonfirmasi pola ekspresi mRNA yang diubah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5A, B, dibandingkan dengan kelompok ME dan kelompok operasi palsu, kadar protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok NPE meningkat secara signifikan (P <0,05). Dibandingkan dengan kelompok operasi palsu, kadar protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok ME juga gagal mencapai perubahan yang signifikan secara statistik (p> 0,05).
(A) Tingkat protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok NPE secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok ME dan kelompok plasebo (P <0,05). (B) Histogram Western blot.
Karena terbatasnya jumlah sampel manusia yang diperoleh selama operasi, studi yang jelas dan terperinci tentang patogenesis MC agak sulit. Kami berusaha membangun model hewan MC untuk mempelajari mekanisme patologis potensial. Pada saat yang sama, evaluasi radiologis, evaluasi histologis dan evaluasi biologis molekuler digunakan untuk mengikuti perjalanan MC yang diinduksi oleh autograft NP. Akibatnya, model implantasi NP menghasilkan perubahan secara bertahap dalam intensitas sinyal dari titik waktu 12 minggu hingga 20 minggu (campuran sinyal rendah dalam urutan T1W dan sinyal rendah dalam urutan T2W), menunjukkan perubahan jaringan, dan histologis dan molekuler Evaluasi biologis mengkonfirmasi hasil studi radiologis.
Hasil percobaan ini menunjukkan bahwa perubahan visual dan histologis terjadi di lokasi pelanggaran tubuh vertebral pada kelompok NPE. Pada saat yang sama, ekspresi gen IL-4, IL-17 dan IFN-γ, serta IL-4, IL-17 dan IFN-γ diamati, menunjukkan bahwa pelanggaran jaringan nukleus pulposus autolog dalam vertebral vertebral Tubuh dapat menyebabkan serangkaian perubahan sinyal dan morfologis. Sangat mudah untuk menemukan bahwa karakteristik sinyal dari tubuh vertebral dari model hewan (sinyal rendah dalam urutan T1W, sinyal campuran dan sinyal rendah dalam urutan T2W) sangat mirip dengan sel vertebral manusia, dan karakteristik MRI juga Konfirmasikan pengamatan histologi dan anatomi kasar, yaitu perubahan sel tubuh vertebral progresif. Meskipun respons inflamasi yang disebabkan oleh trauma akut dapat muncul segera setelah tusukan, hasil MRI menunjukkan bahwa peningkatan perubahan sinyal yang semakin muncul 12 minggu setelah tusukan dan bertahan hingga 20 minggu tanpa ada tanda -tanda pemulihan atau pembalikan perubahan MRI. Hasil ini menunjukkan bahwa NP vertebral autologus adalah metode yang dapat diandalkan untuk membangun MV progresif pada kelinci.
Model tusuk ini membutuhkan keterampilan, waktu, dan upaya bedah yang memadai. Dalam percobaan pendahuluan, diseksi atau stimulasi berlebihan dari struktur ligamen paravertebral dapat mengakibatkan pembentukan osteofit vertebral. Perawatan harus dilakukan untuk tidak merusak atau mengiritasi cakram yang berdekatan. Karena kedalaman penetrasi harus dikontrol untuk mendapatkan hasil yang konsisten dan dapat direproduksi, kami secara manual membuat steker dengan memotong selubung jarum sepanjang 3 mm. Menggunakan steker ini memastikan kedalaman pengeboran yang seragam di tubuh vertebral. Dalam percobaan pendahuluan, tiga ahli bedah ortopedi yang terlibat dalam operasi menemukan 16-gauge jarum lebih mudah untuk bekerja dengan dari 18-gauge jarum atau metode lainnya. Untuk menghindari pendarahan yang berlebihan selama pengeboran, memegang jarum untuk sementara waktu akan memberikan lubang penyisipan yang lebih cocok, menunjukkan bahwa tingkat MC tertentu dapat dikontrol dengan cara ini.
Meskipun banyak penelitian telah menargetkan MC, sedikit yang diketahui tentang etiologi dan patogenesis MC25,26,27. Berdasarkan penelitian kami sebelumnya, kami menemukan bahwa autoimunitas memainkan peran kunci dalam kejadian dan pengembangan MC12. Studi ini meneliti ekspresi kuantitatif IL-4, IL-17, dan IFN-γ, yang merupakan jalur diferensiasi utama sel CD4+ setelah stimulasi antigen. Dalam penelitian kami, dibandingkan dengan kelompok negatif, kelompok NPE memiliki ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ yang lebih tinggi, dan tingkat protein IL-4 dan IL-17 juga lebih tinggi.
Secara klinis, ekspresi mRNA IL-17 meningkat dalam sel NP dari pasien dengan herniasi disk28. Peningkatan tingkat ekspresi IL-4 dan IFN-γ juga ditemukan dalam model herniasi disk non-kompresif akut dibandingkan dengan kontrol yang sehat29. IL-17 memainkan peran kunci dalam peradangan, cedera jaringan pada penyakit autoimun30 dan meningkatkan respons imun terhadap IFN-γ31. Cedera jaringan yang dimediasi IL-17 yang ditingkatkan telah dilaporkan pada tikus MRL/LPR32 dan tikus yang rentan autoimunitas33. IL-4 dapat menghambat ekspresi sitokin proinflamasi (seperti IL-1β dan TNFα) dan aktivasi makrofag34. Dilaporkan bahwa ekspresi mRNA IL-4 berbeda pada kelompok NPE dibandingkan dengan IL-17 dan IFN-γ pada titik waktu yang sama; Ekspresi mRNA IFN-γ dalam kelompok NPE secara signifikan lebih tinggi dari pada kelompok lain. Oleh karena itu, produksi IFN-γ dapat menjadi mediator dari respons inflamasi yang disebabkan oleh interkalasi NP. Studi telah menunjukkan bahwa IFN-γ diproduksi oleh beberapa jenis sel, termasuk sel T helper tipe 1 yang diaktifkan, sel pembunuh alami, dan makrofag35,36, dan merupakan sitokin proinflamasi utama yang mempromosikan respons imun37.
Studi ini menunjukkan bahwa respons autoimun mungkin terlibat dalam terjadinya dan pengembangan MC. Luoma et al. menemukan bahwa karakteristik sinyal MC dan NP yang menonjol serupa pada MRI, dan keduanya menunjukkan sinyal tinggi dalam urutan T2W38. Beberapa sitokin telah dikonfirmasi terkait erat dengan terjadinya MC, seperti IL-139. Ma et al. menyarankan bahwa tonjolan NP ke atas atau ke bawah mungkin memiliki pengaruh besar pada kejadian dan pengembangan MC12. Bobechko40 dan Herzbein et al.41 melaporkan bahwa NP adalah jaringan imunotoleran yang tidak dapat memasuki sirkulasi pembuluh darah sejak lahir. Tonjolan NP memperkenalkan benda asing ke dalam suplai darah, sehingga memediasi reaksi autoimun lokal42. Reaksi autoimun dapat menginduksi sejumlah besar faktor kekebalan tubuh, dan ketika faktor -faktor ini terus terpapar pada jaringan, mereka dapat menyebabkan perubahan pensinyalan43. Dalam penelitian ini, overekspresi IL-4, IL-17 dan IFN-γ adalah faktor kekebalan yang khas, lebih lanjut membuktikan hubungan dekat antara NP dan MCS44. Model hewan ini dengan baik meniru terobosan NP dan masuk ke pelat ujung. Proses ini lebih lanjut mengungkapkan dampak autoimunitas pada MC.
Seperti yang diharapkan, model hewan ini memberi kita platform yang mungkin untuk mempelajari MC. Namun, model ini masih memiliki beberapa keterbatasan: pertama, selama fase pengamatan hewan, beberapa kelinci tahap menengah perlu di-eutanasia untuk pengujian biologi histologis dan molekuler, sehingga beberapa hewan “tidak digunakan” dari waktu ke waktu. Kedua, meskipun tiga titik waktu ditetapkan dalam penelitian ini, sayangnya, kami hanya memodelkan satu jenis MC (perubahan tipe I), jadi tidak cukup untuk mewakili proses pengembangan penyakit manusia, dan lebih banyak titik waktu yang perlu diatur ke lebih baik amati semua perubahan sinyal. Ketiga, perubahan dalam struktur jaringan memang dapat ditunjukkan dengan jelas oleh pewarnaan histologis, tetapi beberapa teknik khusus dapat dengan lebih baik mengungkapkan perubahan mikrostruktur dalam model ini. Misalnya, mikroskop cahaya terpolarisasi digunakan untuk menganalisis pembentukan fibrocartilage pada diskus intervertebralis kelinci45. Efek jangka panjang NP pada MC dan endplate memerlukan studi lebih lanjut.
Lima puluh empat kelinci kulit putih Selandia Baru (berat sekitar 2,5-3 kg, usia 3-3,5 bulan) secara acak dibagi menjadi kelompok operasi palsu, kelompok implantasi otot (kelompok ME) dan kelompok implantasi akar saraf (kelompok NPE). Semua prosedur eksperimental telah disetujui oleh Komite Etika Rumah Sakit Tianjin, dan metode eksperimental dilakukan sesuai dengan pedoman yang disetujui.
Beberapa perbaikan telah dilakukan pada teknik bedah S. sobajima 46. Setiap kelinci ditempatkan pada posisi lantai lateral dan permukaan anterior lima cakram intervertebral lumbar berturut -turut (IVD) terpapar menggunakan pendekatan retroperitoneal posterolateral. Setiap kelinci diberi anestesi umum (20% uretan, 5 ml/kg melalui vena telinga). Sayatan kulit longitudinal dibuat dari tepi bawah tulang rusuk ke pinggiran panggul, 2 cm ventral ke otot paravertebral. Tulang belakang anterolateral kanan dari L1 ke L6 diekspos oleh diseksi tajam dan tumpul dari jaringan subkutan di atasnya, jaringan retroperitoneal, dan otot (Gbr. 6A). Level disk ditentukan dengan menggunakan pinggiran panggul sebagai landmark anatomi untuk level disk L5-L6. Gunakan jarum tusukan 16-gauge untuk mengebor lubang di dekat pelat ujung vertebra L5 hingga kedalaman 3 mm (Gbr. 6b). Gunakan jarum suntik 5-ml untuk aspirasi nukleus pulposus autologous dalam cakram intervertebralis L1-L2 (Gbr. 6C). Lepaskan nukleus pulposus atau otot sesuai dengan kebutuhan masing -masing kelompok. Setelah lubang bor diperdalam, jahitan yang dapat diserap ditempatkan pada fasia yang dalam, fasia dan kulit superfisial, berhati -hati untuk tidak merusak jaringan periosteal tubuh vertebral selama operasi.
(A) Disk L5 -L6 diekspos melalui pendekatan retroperitoneal posterolateral. (B) Gunakan jarum 16-gauge untuk mengebor lubang di dekat pelat akhir L5. (C) MF autologous dipanen.
Anestesi umum diberikan dengan uretan 20% (5 mL/kg) yang diberikan melalui vena telinga, dan radiografi tulang belakang lumbar diulangi pada 12, 16, dan 20 minggu pasca operasi.
Kelinci dikorbankan dengan injeksi ketamin intramuskular (25,0 mg/kg) dan natrium pentobarbital intravena (1,2 g/kg) pada 12, 16 dan 20 minggu setelah operasi. Seluruh tulang belakang dihilangkan untuk analisis histologis dan analisis nyata dilakukan. Transkripsi terbalik kuantitatif (RT-qPCR) dan Western blotting digunakan untuk mendeteksi perubahan faktor kekebalan tubuh.
Pemeriksaan MRI dilakukan pada kelinci menggunakan magnet klinis 3.0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) yang dilengkapi dengan penerima kumparan tungkai ortogonal. Kelinci dibius dengan 20% uretan (5 ml/kg) melalui vena telinga dan kemudian ditempatkan terlentang di dalam magnet dengan daerah lumbar yang berpusat pada koil permukaan melingkar berdiameter 5 inci (sistem medis GE). Gambar localizer T2-weighted koronal (TR, 1445 ms; te, 37 ms) diperoleh untuk menentukan lokasi cakram lumbar dari L3-L4 ke L5-L6. Pesawat sagital T2 irisan tertimbang diperoleh dengan pengaturan berikut: Urutan spin-echo cepat dengan waktu pengulangan (TR) 2200 ms dan waktu gema (TE) 70 ms, matriks; bidang visual 260 dan delapan rangsangan; Ketebalan pemotongan adalah 2 mm, celahnya 0,2 mm.
Setelah foto terakhir diambil dan kelinci terakhir terbunuh, cakram palsu, yang ditanamkan otot, dan NP dihilangkan untuk pemeriksaan histologis. Jaringan difiksasi dalam formalin buffered netral 10% selama 1 minggu, didekali dengan asam ethylenediaminetetraacetic, dan parafin dibagi. Blok jaringan tertanam dalam parafin dan dipotong menjadi bagian sagital (tebal 5 μm) menggunakan mikrotom. Bagian diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E).
Setelah mengumpulkan cakram intervertebralis dari kelinci di masing-masing kelompok, total RNA diekstraksi menggunakan kolom UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Cina) sesuai dengan instruksi pabrik dan sistem transkripsi terbalik II (Promega Inc. , Madison, WI, USA). Transkripsi terbalik dilakukan.
RT-QPCR dilakukan dengan menggunakan PRISM 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) dan SYBR Green Jump Start Taq Readymix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Volume reaksi PCR adalah 20 μl dan mengandung 1,5 μl cDNA encer dan 0,2 μM dari masing -masing primer. Primer dirancang oleh perancang oligoperfect (Invitrogen, Valencia, CA) dan diproduksi oleh Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Cina) (Tabel 1). Kondisi bersepeda termal berikut digunakan: langkah aktivasi polimerase awal pada 94 ° C selama 2 menit, kemudian 40 siklus masing -masing 15 detik pada 94 ° C untuk denaturasi templat, anil selama 1 menit pada 60 ° C, ekstensi, dan fluoresensi. Pengukuran dilakukan selama 1 menit pada 72 ° C. Semua sampel diamplifikasi tiga kali dan nilai rata-rata digunakan untuk analisis RT-QPCR. Data amplifikasi dianalisis menggunakan FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ dinormalisasi dengan kontrol endogen (ACTB). Tingkat ekspresi relatif mRNA target dihitung menggunakan metode 2-ΔΔCT.
Total protein diekstraksi dari jaringan menggunakan homogenizer jaringan dalam buffer lisis ripa (mengandung koktail protease dan fosfatase inhibitor) dan kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 ° C untuk menghilangkan puing -puing jaringan. Lima puluh mikrogram protein dimuat per jalur, dipisahkan oleh 10% SDS-PAGE, dan kemudian ditransfer ke membran PVDF. Pemblokiran dilakukan dalam 5% susu kering tanpa lemak dalam saline-buffered saline (TBS) yang mengandung 0,1% Tween 20 selama 1 jam pada suhu kamar. Membran diinkubasi dengan antibodi primer anti-dekorin kelinci (diencerkan 1: 200; Boster, Wuhan, Cina) (diencerkan 1: 200; Bioss, Beijing, Cina) semalam pada suhu 4 ° C dan bereaksi pada hari-hari kedua; dengan antibodi sekunder (kambing anti-kelinci imunoglobulin G pada 1: 40.000 pengenceran) dikombinasikan dengan peroksidase lobak (Boster, Wuhan, Cina) selama 1 jam pada suhu kamar. Sinyal Western blot terdeteksi oleh peningkatan chemiluminescence pada membran chemiluminescent setelah iradiasi sinar-X. Untuk analisis densitometri, bercak dipindai dan dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak bandscan dan hasilnya dinyatakan sebagai rasio imunoreaktivitas gen target terhadap imunoreaktivitas tubulin.
Perhitungan statistik dilakukan dengan menggunakan paket perangkat lunak SPSS16.0 (SPSS, USA). Data yang dikumpulkan selama penelitian dinyatakan sebagai rata-rata ± standar deviasi (rata-rata ± SD) dan dianalisis menggunakan analisis tindakan berulang satu arah varians (ANOVA) untuk menentukan perbedaan antara kedua kelompok. P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Dengan demikian, pembentukan model hewan MC dengan menanamkan NP autologus ke dalam tubuh vertebral dan melakukan pengamatan makroanatomik, analisis MRI, evaluasi histologis dan analisis biologis molekuler dapat menjadi alat yang penting untuk menilai dan memahami mekanisme MC manusia dan mengembangkan terapi baru yang baru. intervensi.
Cara mengutip artikel ini: Han, C. et al. Model hewan perubahan modis ditetapkan dengan menanamkan nukleus pulposus autologus ke dalam tulang subkondral tulang belakang lumbar. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/SREP35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. Magnetic resonance imaging of the lumbar spine: prevalence of disc herniation and retention, nerve root compression, end plate abnormalities, and facet joint osteoarthritis in asymptomatic volunteers . kecepatan. Radiologi 209, 661–666, doi: 10.1148/radiologi.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, dan Leboeuf-eed, K. Perubahan modik dan hubungannya dengan temuan klinis. Jurnal Tulang Belakang Eropa: Publikasi Resmi Masyarakat Tulang Belakang Eropa, Masyarakat Deformitas Tulang Belakang Eropa, dan Masyarakat Eropa untuk Penelitian Tulang Belakang Leher 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-X (2006).
Kuisma, M., et al. Perubahan modik dalam pelat akhir vertebral lumbar: prevalensi dan hubungan dengan nyeri punggung bawah dan linu panggul pada pekerja laki-laki paruh baya. Tulang belakang 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., dan Dalinka, M. MRI perubahan sumsum tulang di dekat pelat akhir pada penyakit degeneratif tulang belakang lumbar. Ajr. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, dan Carter, JR Degenerative Disc Disease: Evaluasi Perubahan Sumsum Vertebral dengan MRI. Radiologi 166, 193–199, doi: 10.1148/radiologi.166.1.33366678 (1988).
Modik, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, dan Carter, JR pencitraan penyakit cakram degeneratif. Radiologi 168, 177–186, doi: 10.1148/radiologi.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, dkk. Prediktor perubahan sinyal endplate neovertebral (modik) pada populasi umum. Jurnal Tulang Belakang Eropa: Publikasi Resmi Masyarakat Tulang Belakang Eropa, Masyarakat Deformitas Tulang Belakang Eropa, dan Masyarakat Eropa untuk Penelitian Tulang Belakang Leher, Divisi 19, 129–135, doi: 10.1007/S00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB dan Mannisch, K. Modic berubah setelah herniasi disk lumbar. European Spine Journal: Publikasi resmi Masyarakat Tulang Belakang Eropa, Masyarakat Deformitas Tulang Belakang Eropa dan Masyarakat Eropa untuk Penelitian Tulang Belakang Leher 16, 977–982, DOI: 10.1007/S00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., dan Kaapa, E. Perubahan tipe I modis dapat memprediksi degenerasi disk deformasi progresif cepat: studi prospektif 1 tahun. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ dan Fan, SW Perubahan Modik: Kemungkinan Penyebab dan Kontribusi untuk Degenerasi Disc Lumbar. Hipotesis Medis 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Internal Disc Rupture. Masalah prolaps disk selama 50 tahun. Spine (Phila PA 1976) 11, 650-653 (1986).
Waktu posting: Des-13-2024