Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk hasil terbaik, sebaiknya gunakan browser yang lebih baru (atau nonaktifkan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Pembentukan model hewan perubahan modik (MC) merupakan dasar penting untuk mempelajari MC. Lima puluh empat kelinci New Zealand White dibagi menjadi kelompok operasi palsu, kelompok implantasi otot (kelompok ME) dan kelompok implantasi nukleus pulposus (kelompok NPE). Pada kelompok NPE, diskus intervertebralis diekspos dengan pendekatan bedah lumbal anterolateral dan jarum digunakan untuk menusuk badan vertebra L5 di dekat pelat ujung. NP diekstraksi dari diskus intervertebralis L1/2 dengan jarum suntik dan disuntikkan ke dalamnya. Mengebor lubang di tulang subchondral. Prosedur pembedahan dan metode pengeboran pada kelompok implantasi otot dan kelompok operasi palsu sama dengan kelompok implantasi NP. Pada kelompok ME, sepotong otot dimasukkan ke dalam lubang, sedangkan pada kelompok operasi palsu, tidak ada yang dimasukkan ke dalam lubang. Setelah operasi, pemindaian MRI dan pengujian biologi molekuler dilakukan. Sinyal pada kelompok NPE berubah, namun tidak ada perubahan sinyal yang jelas pada kelompok operasi palsu dan kelompok ME. Pengamatan histologis menunjukkan bahwa proliferasi jaringan abnormal diamati di tempat implantasi, dan ekspresi IL-4, IL-17 dan IFN-γ meningkat pada kelompok NPE. Implantasi NP ke dalam tulang subkondral dapat membentuk model hewan MC.
Perubahan Modic (MC) adalah lesi pada endplate vertebra dan sumsum tulang di dekatnya yang terlihat pada magnetic resonance imaging (MRI). Penyakit ini cukup umum terjadi pada individu dengan gejala terkait1. Banyak penelitian telah menekankan pentingnya MC karena hubungannya dengan nyeri punggung bawah (LBP)2,3. de Roos et al.4 dan Modic et al.5 secara independen pertama kali menjelaskan tiga jenis kelainan sinyal subkondral pada sumsum tulang belakang. Perubahan tipe I yang modik bersifat hipointens pada sekuens berbobot T1 (T1W) dan hiperintens pada sekuens berbobot T2 (T2W). Lesi ini memperlihatkan fisura endplate dan jaringan granulasi pembuluh darah yang berdekatan di sumsum tulang. Perubahan modic tipe II menunjukkan sinyal tinggi pada urutan T1W dan T2W. Pada jenis lesi ini, kerusakan endplate dapat ditemukan, serta penggantian lemak histologis pada sumsum tulang yang berdekatan. Perubahan modic tipe III menunjukkan sinyal rendah pada rangkaian T1W dan T2W. Lesi sklerotik yang berhubungan dengan pelat ujung telah diamati6. MC dianggap sebagai penyakit patologis tulang belakang dan berhubungan erat dengan banyak penyakit degeneratif tulang belakang7,8,9.
Mengingat data yang tersedia, beberapa penelitian telah memberikan wawasan rinci mengenai etiologi dan mekanisme patologis MC. Albert dkk. menyarankan bahwa MC mungkin disebabkan oleh herniasi diskus8. Hu dkk. mengaitkan MC dengan degenerasi diskus yang parah10. Kroc mengusulkan konsep “pecahnya cakram internal”, yang menyatakan bahwa trauma cakram yang berulang dapat menyebabkan robekan mikro pada pelat ujung. Setelah pembentukan celah, penghancuran endplate oleh nukleus pulposus (NP) dapat memicu respons autoimun, yang selanjutnya mengarah pada perkembangan MC11. Ma dkk. berbagi pandangan serupa dan melaporkan bahwa autoimunitas yang diinduksi NP memainkan peran kunci dalam patogenesis MC12.
Sel sistem kekebalan tubuh, terutama limfosit T helper CD4+, memainkan peran penting dalam patogenesis autoimun13. Subset Th17 yang baru ditemukan menghasilkan sitokin proinflamasi IL-17, meningkatkan ekspresi kemokin, dan menstimulasi sel T pada organ yang rusak untuk memproduksi IFN-γ14. Sel Th2 juga memainkan peran unik dalam patogenesis respon imun. Ekspresi IL-4 sebagai perwakilan sel Th2 dapat menyebabkan konsekuensi imunopatologis yang parah15.
Meskipun banyak studi klinis telah dilakukan pada MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, masih kurangnya model percobaan hewan yang sesuai yang dapat meniru proses MC yang sering terjadi pada manusia dan dapat digunakan untuk menyelidiki etiologi atau pengobatan baru seperti terapi bertarget. Sampai saat ini, hanya beberapa model hewan MC yang dilaporkan mempelajari mekanisme patologis yang mendasarinya.
Berdasarkan teori autoimun yang dikemukakan oleh Albert dan Ma, penelitian ini membuat model MC kelinci yang sederhana dan dapat direproduksi dengan melakukan autotransplantasi NP di dekat pelat ujung tulang belakang yang dibor. Tujuan lainnya adalah untuk mengamati karakteristik histologis model hewan dan mengevaluasi mekanisme spesifik NP dalam pengembangan MC. Untuk tujuan ini, kami menggunakan teknik seperti biologi molekuler, MRI, dan studi histologis untuk mempelajari perkembangan MC.
Dua kelinci mati karena pendarahan selama operasi, dan empat kelinci mati selama anestesi selama MRI. 48 kelinci sisanya selamat dan tidak menunjukkan tanda-tanda perilaku atau neurologis setelah operasi.
MRI menunjukkan bahwa intensitas sinyal jaringan yang tertanam di lubang yang berbeda berbeda-beda. Intensitas sinyal dari badan vertebra L5 pada kelompok NPE secara bertahap berubah pada 12, 16 dan 20 minggu setelah penyisipan (urutan T1W menunjukkan sinyal rendah, dan urutan T2W menunjukkan sinyal campuran ditambah sinyal rendah) (Gbr. 1C), sedangkan tampilan MRI dari dua kelompok bagian tertanam lainnya tetap relatif stabil selama periode yang sama (Gbr. 1A, B).
(A) MRI berurutan yang mewakili tulang belakang lumbal kelinci pada 3 titik waktu. Tidak ada kelainan sinyal yang ditemukan pada gambar kelompok operasi palsu. (B) Karakteristik sinyal dari badan vertebral pada kelompok ME mirip dengan kelompok operasi palsu, dan tidak ada perubahan sinyal signifikan yang diamati pada lokasi penanaman seiring waktu. (C) Pada kelompok NPE, sinyal rendah terlihat jelas pada urutan T1W, dan sinyal campuran dan sinyal rendah terlihat jelas pada urutan T2W. Dari periode 12 minggu hingga periode 20 minggu, sinyal tinggi sporadis di sekitar sinyal rendah dalam rangkaian T2W menurun.
Hiperplasia tulang yang jelas dapat dilihat di tempat implantasi badan vertebra pada kelompok NPE, dan hiperplasia tulang terjadi lebih cepat dari 12 hingga 20 minggu (Gambar 2C) dibandingkan dengan kelompok NPE, tidak ada perubahan signifikan yang diamati pada model tulang belakang. badan; Grup palsu dan grup ME (Gbr. 2C) 2A,B).
(A) Permukaan badan vertebra pada bagian yang ditanam sangat halus, lubangnya sembuh dengan baik, dan tidak ada hiperplasia pada badan vertebra. (B) Bentuk lokasi implan pada kelompok ME mirip dengan kelompok operasi palsu, dan tidak ada perubahan nyata pada tampilan lokasi implan seiring berjalannya waktu. (C) Hiperplasia tulang terjadi di tempat implantasi pada kelompok NPE. Hiperplasia tulang meningkat dengan cepat dan bahkan meluas melalui diskus intervertebralis ke badan vertebra kontralateral.
Analisis histologis memberikan informasi lebih rinci tentang pembentukan tulang. Gambar 3 menunjukkan foto-foto bagian pasca operasi yang diwarnai dengan H&E. Pada kelompok operasi palsu, kondrosit tersusun dengan baik dan tidak ada proliferasi sel yang terdeteksi (Gambar 3A). Situasi pada kelompok ME serupa dengan situasi pada kelompok operasi palsu (Gambar 3B). Namun, pada kelompok NPE, sejumlah besar kondrosit dan proliferasi sel mirip NP diamati di lokasi implantasi (Gambar 3C);
(A) Trabekula terlihat di dekat pelat ujung, kondrosit tersusun rapi dengan ukuran dan bentuk sel seragam serta tidak berproliferasi (40 kali). (B) Kondisi tempat implantasi pada kelompok ME mirip dengan kelompok palsu. Trabekula dan kondrosit dapat terlihat, namun tidak ada proliferasi yang jelas di tempat implantasi (40 kali). (B) Terlihat bahwa kondrosit dan sel mirip NP berkembang biak secara signifikan, dan bentuk serta ukuran kondrosit tidak merata (40 kali lipat).
Ekspresi interleukin 4 (IL-4) mRNA, interleukin 17 (IL-17) mRNA, dan interferon γ (IFN-γ) mRNA diamati pada kelompok NPE dan ME. Ketika tingkat ekspresi gen target dibandingkan, ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ meningkat secara signifikan pada kelompok NPE dibandingkan dengan kelompok ME dan kelompok operasi palsu (Gbr. 4) (P <0,05). Dibandingkan dengan kelompok operasi palsu, tingkat ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ pada kelompok ME hanya meningkat sedikit dan tidak mencapai perubahan statistik (P > 0,05).
Ekspresi mRNA IL-4, IL-17 dan IFN-γ pada kelompok NPE menunjukkan tren yang jauh lebih tinggi dibandingkan pada kelompok operasi palsu dan kelompok ME (P <0,05).
Sebaliknya, tingkat ekspresi pada kelompok ME tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (P>0,05).
Analisis Western blot dilakukan menggunakan antibodi yang tersedia secara komersial terhadap IL-4 dan IL-17 untuk mengkonfirmasi perubahan pola ekspresi mRNA. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5A,B, dibandingkan dengan kelompok ME dan kelompok operasi palsu, kadar protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok NPE meningkat secara signifikan (P <0,05). Dibandingkan dengan kelompok operasi palsu, kadar protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok ME juga gagal mencapai perubahan yang signifikan secara statistik (P>0,05).
(A) Kadar protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok NPE secara signifikan lebih tinggi dibandingkan pada kelompok ME dan kelompok plasebo (P <0,05). (B) Histogram noda barat.
Karena terbatasnya jumlah sampel manusia yang diperoleh selama operasi, studi yang jelas dan rinci mengenai patogenesis MC agak sulit. Kami berusaha membuat model hewan MC untuk mempelajari potensi mekanisme patologisnya. Pada saat yang sama, evaluasi radiologi, evaluasi histologis dan evaluasi biologi molekuler digunakan untuk mengikuti jalannya MC yang diinduksi oleh NP autograft. Hasilnya, model implantasi NP menghasilkan perubahan bertahap dalam intensitas sinyal dari titik waktu 12 minggu ke 20 minggu (campuran sinyal rendah dalam rangkaian T1W dan sinyal rendah dalam rangkaian T2W), yang menunjukkan perubahan jaringan, serta perubahan histologis dan molekuler. evaluasi biologis mengkonfirmasi hasil studi radiologi.
Hasil percobaan ini menunjukkan bahwa terjadi perubahan visual dan histologis pada lokasi pelanggaran badan vertebra pada kelompok NPE. Pada saat yang sama, ekspresi gen IL-4, IL-17 dan IFN-γ, serta IL-4, IL-17 dan IFN-γ diamati, menunjukkan bahwa pelanggaran jaringan nukleus pulposus autologous di tulang belakang tubuh dapat menyebabkan serangkaian perubahan sinyal dan morfologi. Sangat mudah untuk menemukan bahwa karakteristik sinyal dari tubuh vertebral model hewan (sinyal rendah dalam urutan T1W, sinyal campuran dan sinyal rendah dalam urutan T2W) sangat mirip dengan sel-sel tulang belakang manusia, dan karakteristik MRI juga mengkonfirmasi pengamatan histologi dan anatomi kasar, yaitu perubahan sel-sel tubuh vertebra bersifat progresif. Meskipun respons inflamasi yang disebabkan oleh trauma akut mungkin muncul segera setelah penusukan, hasil MRI menunjukkan bahwa perubahan sinyal yang semakin meningkat muncul 12 minggu setelah penusukan dan bertahan hingga 20 minggu tanpa ada tanda-tanda pemulihan atau pembalikan perubahan MRI. Hasil ini menunjukkan bahwa NP vertebral autologus adalah metode yang dapat diandalkan untuk membentuk MV progresif pada kelinci.
Model tusukan ini memerlukan keterampilan, waktu, dan upaya bedah yang memadai. Dalam percobaan awal, diseksi atau stimulasi berlebihan pada struktur ligamen paravertebral dapat menyebabkan pembentukan osteofit vertebra. Berhati-hatilah agar tidak merusak atau mengiritasi disk yang berdekatan. Karena kedalaman penetrasi harus dikontrol untuk mendapatkan hasil yang konsisten dan dapat direproduksi, kami membuat sumbat secara manual dengan memotong selubung jarum sepanjang 3 mm. Menggunakan sumbat ini memastikan kedalaman pengeboran yang seragam di badan vertebra. Dalam percobaan awal, tiga ahli bedah ortopedi yang terlibat dalam operasi tersebut menemukan bahwa jarum berukuran 16 lebih mudah digunakan dibandingkan dengan jarum berukuran 18 atau metode lainnya. Untuk menghindari pendarahan yang berlebihan selama pengeboran, menahan jarum selama beberapa saat akan menghasilkan lubang penyisipan yang lebih sesuai, menunjukkan bahwa tingkat MC tertentu dapat dikontrol dengan cara ini.
Meskipun banyak penelitian menargetkan MC, sedikit yang diketahui tentang etiologi dan patogenesis MC25,26,27. Berdasarkan penelitian kami sebelumnya, kami menemukan bahwa autoimunitas memainkan peran penting dalam terjadinya dan perkembangan MC12. Penelitian ini menguji ekspresi kuantitatif IL-4, IL-17, dan IFN-γ, yang merupakan jalur diferensiasi utama sel CD4+ setelah stimulasi antigen. Dalam penelitian kami, dibandingkan dengan kelompok negatif, kelompok NPE memiliki ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ yang lebih tinggi, dan kadar protein IL-4 dan IL-17 juga lebih tinggi.
Secara klinis, ekspresi IL-17 mRNA meningkat pada sel NP dari pasien dengan herniasi diskus28. Peningkatan tingkat ekspresi IL-4 dan IFN-γ juga ditemukan pada model herniasi diskus non-kompresi akut dibandingkan dengan kontrol yang sehat29. IL-17 memainkan peran penting dalam peradangan, cedera jaringan pada penyakit autoimun30 dan meningkatkan respon imun terhadap IFN-γ31. Peningkatan cedera jaringan yang dimediasi IL-17 telah dilaporkan pada tikus MRL/lpr32 dan tikus yang rentan terhadap autoimun33. IL-4 dapat menghambat ekspresi sitokin proinflamasi (seperti IL-1β dan TNFα) dan aktivasi makrofag34. Dilaporkan bahwa ekspresi mRNA IL-4 berbeda pada kelompok NPE dibandingkan dengan IL-17 dan IFN-γ pada titik waktu yang sama; Ekspresi mRNA IFN-γ pada kelompok NPE secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok lain. Oleh karena itu, produksi IFN-γ mungkin menjadi mediator respon inflamasi yang disebabkan oleh interkalasi NP. Penelitian telah menunjukkan bahwa IFN-γ diproduksi oleh berbagai jenis sel, termasuk sel T pembantu tipe 1 yang teraktivasi, sel pembunuh alami, dan makrofag35,36, dan merupakan sitokin proinflamasi utama yang meningkatkan respons imun37.
Studi ini menunjukkan bahwa respon autoimun mungkin terlibat dalam terjadinya dan perkembangan MC. Luoma dkk. menemukan bahwa karakteristik sinyal MC dan NP yang menonjol serupa pada MRI, dan keduanya menunjukkan sinyal tinggi pada urutan T2W38. Beberapa sitokin telah dipastikan berkaitan erat dengan terjadinya MC, seperti IL-139. Ma dkk. menyarankan bahwa penonjolan NP ke atas atau ke bawah mungkin memiliki pengaruh besar terhadap terjadinya dan perkembangan MC12. Bobechko40 dan Herzbein et al.41 melaporkan bahwa NP adalah jaringan imunotoleran yang tidak dapat memasuki sirkulasi pembuluh darah sejak lahir. Tonjolan NP memasukkan benda asing ke dalam suplai darah, sehingga memediasi reaksi autoimun lokal42. Reaksi autoimun dapat menginduksi sejumlah besar faktor imun, dan ketika faktor-faktor ini terus-menerus terpapar pada jaringan, hal ini dapat menyebabkan perubahan sinyal43. Dalam penelitian ini, ekspresi berlebih dari IL-4, IL-17 dan IFN-γ merupakan faktor imun yang khas, yang selanjutnya membuktikan hubungan erat antara NP dan MCs44. Model hewan ini meniru dengan baik terobosan NP dan masuk ke pelat ujung. Proses ini selanjutnya mengungkap dampak autoimunitas pada MC.
Seperti yang diharapkan, model hewan ini memberi kita platform yang memungkinkan untuk mempelajari MC. Namun, model ini masih memiliki beberapa keterbatasan: pertama, selama fase observasi hewan, beberapa kelinci tahap menengah perlu di-eutanasia untuk pengujian biologi histologis dan molekuler, sehingga beberapa hewan “tidak lagi digunakan” seiring berjalannya waktu. Kedua, meskipun tiga titik waktu ditetapkan dalam penelitian ini, sayangnya, kami hanya memodelkan satu jenis MC (perubahan Modic tipe I), sehingga tidak cukup untuk mewakili proses perkembangan penyakit manusia, dan lebih banyak titik waktu yang perlu ditetapkan untuk lebih baik amati semua perubahan sinyal. Ketiga, perubahan struktur jaringan memang dapat ditunjukkan dengan jelas melalui pewarnaan histologis, namun beberapa teknik khusus dapat mengungkapkan perubahan mikrostruktur pada model ini dengan lebih baik. Misalnya, mikroskop cahaya terpolarisasi digunakan untuk menganalisis pembentukan fibrokartilago pada cakram intervertebralis kelinci45. Efek jangka panjang NP pada MC dan endplate memerlukan penelitian lebih lanjut.
Lima puluh empat kelinci putih Selandia Baru jantan (berat sekitar 2,5-3 kg, umur 3-3,5 bulan) secara acak dibagi menjadi kelompok operasi palsu, kelompok implantasi otot (kelompok ME) dan kelompok implantasi akar saraf (kelompok NPE). Semua prosedur eksperimental telah disetujui oleh Komite Etik Rumah Sakit Tianjin, dan metode eksperimental dilakukan sesuai dengan pedoman yang disetujui.
Beberapa perbaikan telah dilakukan pada teknik bedah S. Sobajima 46 . Setiap kelinci ditempatkan dalam posisi berbaring lateral dan permukaan anterior dari lima cakram intervertebralis lumbal (IVD) berturut-turut diekspos menggunakan pendekatan retroperitoneal posterolateral. Setiap kelinci diberi anestesi umum (20% uretan, 5 ml/kg melalui vena telinga). Sayatan kulit memanjang dibuat dari tepi bawah tulang rusuk hingga pinggiran panggul, 2 cm di bagian ventral otot paravertebral. Tulang belakang anterolateral kanan dari L1 hingga L6 terlihat melalui diseksi tajam dan tumpul pada jaringan subkutan, jaringan retroperitoneal, dan otot di atasnya (Gambar 6A). Tingkat diskus ditentukan dengan menggunakan pinggiran panggul sebagai penanda anatomi untuk tingkat diskus L5-L6. Gunakan jarum tusuk berukuran 16 untuk mengebor lubang di dekat pelat ujung vertebra L5 hingga kedalaman 3 mm (Gbr. 6B). Gunakan jarum suntik 5 ml untuk mengaspirasi nukleus pulposus autologus pada diskus intervertebralis L1-L2 (Gbr. 6C). Buang nukleus pulposus atau otot sesuai kebutuhan masing-masing kelompok. Setelah lubang bor diperdalam, jahitan yang dapat diserap ditempatkan pada fasia dalam, fasia superfisial, dan kulit, dengan hati-hati agar tidak merusak jaringan periosteal pada badan vertebra selama operasi.
(A) Diskus L5–L6 diekspos melalui pendekatan retroperitoneal posterolateral. (B) Gunakan jarum ukuran 16 untuk mengebor lubang di dekat pelat ujung L5. (C) MF autologus dipanen.
Anestesi umum diberikan dengan uretan 20% (5 ml/kg) yang diberikan melalui vena telinga, dan radiografi tulang belakang lumbal diulang pada 12, 16, dan 20 minggu pasca operasi.
Kelinci dikorbankan dengan injeksi ketamin intramuskular (25,0 mg/kg) dan natrium pentobarbital intravena (1,2 g/kg) pada 12, 16 dan 20 minggu setelah operasi. Seluruh tulang belakang diangkat untuk analisis histologis dan analisis nyata dilakukan. Transkripsi terbalik kuantitatif (RT-qPCR) dan Western blotting digunakan untuk mendeteksi perubahan faktor kekebalan.
Pemeriksaan MRI dilakukan pada kelinci menggunakan magnet klinis 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) yang dilengkapi dengan penerima kumparan ekstremitas ortogonal. Kelinci dibius dengan uretan 20% (5 mL/kg) melalui vena telinga dan kemudian ditempatkan terlentang di dalam magnet dengan daerah pinggang dipusatkan pada kumparan permukaan melingkar berdiameter 5 inci (GE Medical Systems). Gambar localizer berbobot T2 koroner (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) diperoleh untuk menentukan lokasi cakram lumbal dari L3 – L4 ke L5 – L6. Irisan berbobot T2 bidang sagital diperoleh dengan pengaturan berikut: urutan spin-gema cepat dengan waktu pengulangan (TR) 2200 ms dan waktu gema (TE) 70 ms, matriks; bidang visual 260 dan delapan rangsangan; Ketebalan pemotongan 2 mm, jarak bebas 0,2 mm.
Setelah foto terakhir diambil dan kelinci terakhir dibunuh, cakram palsu, yang tertanam di otot, dan NP dikeluarkan untuk pemeriksaan histologis. Jaringan difiksasi dalam formalin buffer netral 10% selama 1 minggu, didekalsifikasi dengan asam etilendiamintetraasetat, dan dipotong parafin. Blok jaringan ditanamkan dalam parafin dan dipotong menjadi bagian sagital (tebal 5 μm) menggunakan mikrotom. Bagian diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E).
Setelah mengumpulkan cakram intervertebralis dari kelinci di masing-masing kelompok, total RNA diekstraksi menggunakan kolom UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) sesuai dengan instruksi pabrik dan sistem transkripsi terbalik ImProm II (Promega Inc. , Madison, WI, AS). Transkripsi terbalik dilakukan.
RT-qPCR dilakukan menggunakan Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) dan SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Volume reaksi PCR adalah 20 μl dan mengandung 1,5 μl cDNA encer dan 0,2 μM setiap primer. Primer dirancang oleh OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) dan diproduksi oleh Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Cina) (Tabel 1). Kondisi siklus termal berikut digunakan: langkah aktivasi polimerase awal pada 94°C selama 2 menit, kemudian 40 siklus masing-masing 15 detik pada 94°C untuk denaturasi templat, anil selama 1 menit pada 60°C, ekstensi, dan fluoresensi. pengukuran dilakukan selama 1 menit pada suhu 72°C. Semua sampel diamplifikasi tiga kali dan nilai rata-ratanya digunakan untuk analisis RT-qPCR. Data amplifikasi dianalisis menggunakan FlexStation 3 (Perangkat Molekuler, Sunnyvale, CA, USA). Ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ dinormalisasi menjadi kontrol endogen (ACTB). Tingkat ekspresi relatif dari target mRNA dihitung menggunakan metode 2-ΔΔCT.
Total protein diekstraksi dari jaringan menggunakan homogenizer jaringan dalam buffer lisis RIPA (mengandung koktail protease dan inhibitor fosfatase) dan kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C untuk menghilangkan sisa-sisa jaringan. Lima puluh mikrogram protein dimuat per jalur, dipisahkan dengan 10% SDS-PAGE, dan kemudian dipindahkan ke membran PVDF. Pemblokiran dilakukan dalam susu kering tanpa lemak 5% dalam larutan Tris-buffered saline (TBS) yang mengandung 0,1% Tween 20 selama 1 jam pada suhu kamar. Membran diinkubasi dengan antibodi primer anti-decorin kelinci (diencerkan 1:200; Boster, Wuhan, Tiongkok) (diencerkan 1:200; Bioss, Beijing, Tiongkok) semalaman pada suhu 4°C dan direaksikan pada hari kedua; dengan antibodi sekunder (immunoglobulin G anti-kelinci kambing pada pengenceran 1:40.000) dikombinasikan dengan peroksidase lobak (Boster, Wuhan, Cina) selama 1 jam pada suhu kamar. Sinyal Western blot terdeteksi oleh peningkatan chemiluminescence pada membran chemiluminescent setelah penyinaran sinar-X. Untuk analisis densitometri, bercak dipindai dan diukur menggunakan perangkat lunak BandScan dan hasilnya dinyatakan sebagai rasio imunoreaktivitas gen target terhadap imunoreaktivitas tubulin.
Perhitungan statistik dilakukan dengan menggunakan paket perangkat lunak SPSS16.0 (SPSS, USA). Data yang dikumpulkan selama penelitian dinyatakan sebagai rata-rata ± standar deviasi (rata-rata ± SD) dan dianalisis menggunakan analisis varians pengukuran berulang satu arah (ANOVA) untuk menentukan perbedaan antara kedua kelompok. P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Dengan demikian, pembentukan model hewan MC dengan menanamkan NP autologus ke dalam tubuh vertebral dan melakukan observasi makroanatomi, analisis MRI, evaluasi histologis dan analisis biologi molekuler dapat menjadi alat penting untuk menilai dan memahami mekanisme MC manusia dan mengembangkan terapi baru. intervensi.
Cara mengutip artikel ini : Han, C. et al. Model hewan perubahan Modic dibuat dengan menanamkan nukleus pulposus autologus ke dalam tulang subkondral tulang belakang lumbal. Sains. Rep.6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., dan Boos, N. Pencitraan resonansi magnetik tulang belakang lumbal: prevalensi herniasi dan retensi diskus, kompresi akar saraf, kelainan pelat ujung, dan osteoartritis sendi facet pada sukarelawan tanpa gejala . kecepatan. Radiologi 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, dan Leboeuf-Eed, K. Perubahan Modic dan hubungannya dengan temuan klinis. Jurnal Tulang Belakang Eropa: publikasi resmi dari European Spine Society, European Society of Spinal Deformity, dan European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., dkk. Perubahan kecil pada endplate vertebra lumbal: prevalensi dan hubungan dengan nyeri punggung bawah dan linu panggul pada pekerja pria paruh baya. Tulang belakang 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., dan Dalinka, M. MRI perubahan sumsum tulang di dekat pelat ujung pada penyakit degeneratif tulang belakang lumbal. AJR. Jurnal Radiologi Amerika 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, dan Carter, JR Penyakit cakram degeneratif: evaluasi perubahan sumsum tulang belakang dengan MRI. Radiologi 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, dan Carter, JR Pencitraan penyakit cakram degeneratif. Radiologi 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, dkk. Prediktor perubahan sinyal neovertebral endplate (Modic) pada populasi umum. Jurnal Tulang Belakang Eropa: Publikasi Resmi Masyarakat Tulang Belakang Eropa, Masyarakat Deformitas Tulang Belakang Eropa, dan Masyarakat Eropa untuk Penelitian Tulang Belakang Serviks, Divisi 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB dan Mannisch, K. Perubahan Modic setelah herniasi lumbal. Jurnal Tulang Belakang Eropa: Publikasi Resmi European Spine Society, European Society of Spinal Deformity dan European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., dan Kaapa, E. Perubahan tipe I Modic dapat memprediksi degenerasi cakram deformasi progresif cepat: studi prospektif 1 tahun. Jurnal Tulang Belakang Eropa 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ dan Fan, SW Perubahan Modic: kemungkinan penyebab dan kontribusi terhadap degenerasi cakram lumbal. Hipotesis Medis 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Pecahnya cakram bagian dalam. Masalah prolaps diskus selama 50 tahun. Tulang Belakang (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Waktu posting: 13 Des-2024