Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk hasil terbaik, kami sarankan menggunakan peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Pembentukan model hewan untuk perubahan Modic (MC) merupakan dasar penting untuk mempelajari MC. Lima puluh empat kelinci New Zealand White dibagi menjadi kelompok operasi semu, kelompok implantasi otot (kelompok ME), dan kelompok implantasi nukleus pulposus (kelompok NPE). Pada kelompok NPE, diskus intervertebralis diekspos melalui pendekatan bedah lumbal anterolateral dan jarum digunakan untuk menusuk badan vertebra L5 di dekat lempeng ujung. NP diekstraksi dari diskus intervertebralis L1/2 dengan jarum suntik dan disuntikkan ke dalamnya. Lubang dibor pada tulang subkondral. Prosedur bedah dan metode pengeboran pada kelompok implantasi otot dan kelompok operasi semu sama dengan yang ada pada kelompok implantasi NP. Pada kelompok ME, sepotong otot ditempatkan ke dalam lubang, sedangkan pada kelompok operasi semu, tidak ada yang ditempatkan ke dalam lubang. Setelah operasi, dilakukan pemindaian MRI dan pengujian biologi molekuler. Sinyal pada kelompok NPE berubah, tetapi tidak ada perubahan sinyal yang jelas pada kelompok operasi semu dan kelompok ME. Pengamatan histologis menunjukkan bahwa proliferasi jaringan abnormal diamati di lokasi implantasi, dan ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ meningkat pada kelompok NPE. Implantasi NP ke dalam tulang subkondral dapat membentuk model hewan MC.
Perubahan Modic (MC) adalah lesi pada lempeng ujung vertebra dan sumsum tulang yang berdekatan yang terlihat pada pencitraan resonansi magnetik (MRI). Lesi ini cukup umum terjadi pada individu dengan gejala terkait¹. Banyak penelitian telah menekankan pentingnya MC karena hubungannya dengan nyeri punggung bawah (LBP)²,³. de Roos dkk.⁴ dan Modic dkk.⁵ secara independen pertama kali mendeskripsikan tiga jenis kelainan sinyal subkondral yang berbeda pada sumsum tulang vertebra. Perubahan Modic tipe I bersifat hipointens pada sekuens T1-weighted (T1W) dan hiperintens pada sekuens T2-weighted (T2W). Lesi ini memperlihatkan retakan pada lempeng ujung dan jaringan granulasi vaskular yang berdekatan di sumsum tulang. Perubahan Modic tipe II menunjukkan sinyal tinggi pada sekuens T1W dan T2W. Pada jenis lesi ini, dapat ditemukan kerusakan lempeng ujung, serta penggantian lemak histologis pada sumsum tulang yang berdekatan. Perubahan Modic tipe III menunjukkan sinyal rendah pada sekuens T1W dan T2W. Lesi sklerotik yang sesuai dengan lempeng ujung telah diamati⁶. MC dianggap sebagai penyakit patologis tulang belakang dan berhubungan erat dengan banyak penyakit degeneratif tulang belakang7,8,9.
Berdasarkan data yang tersedia, beberapa penelitian telah memberikan wawasan rinci mengenai etiologi dan mekanisme patologis MC. Albert dkk. menyatakan bahwa MC mungkin disebabkan oleh herniasi diskus8. Hu dkk. mengaitkan MC dengan degenerasi diskus yang parah10. Kroc mengusulkan konsep "ruptur diskus internal," yang menyatakan bahwa trauma diskus berulang dapat menyebabkan robekan mikro pada lempeng ujung. Setelah pembentukan celah, kerusakan lempeng ujung oleh nukleus pulposus (NP) dapat memicu respons autoimun, yang selanjutnya menyebabkan perkembangan MC11. Ma dkk. memiliki pandangan serupa dan melaporkan bahwa autoimunitas yang diinduksi NP memainkan peran kunci dalam patogenesis MC12.
Sel-sel sistem imun, terutama limfosit T helper CD4+, memainkan peran penting dalam patogenesis autoimunitas13. Subset Th17 yang baru ditemukan menghasilkan sitokin proinflamasi IL-17, mendorong ekspresi kemokin, dan merangsang sel T di organ yang rusak untuk menghasilkan IFN-γ14. Sel Th2 juga memainkan peran unik dalam patogenesis respons imun. Ekspresi IL-4 sebagai sel Th2 representatif dapat menyebabkan konsekuensi imunopatologis yang parah15.
Meskipun banyak studi klinis telah dilakukan pada MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, masih terdapat kekurangan model eksperimental hewan yang sesuai yang dapat meniru proses MC yang sering terjadi pada manusia dan dapat digunakan untuk menyelidiki etiologi atau pengobatan baru seperti terapi target. Hingga saat ini, hanya sedikit model hewan MC yang telah dilaporkan untuk mempelajari mekanisme patologis yang mendasarinya.
Berdasarkan teori autoimun yang dikemukakan oleh Albert dan Ma, penelitian ini membangun model MC kelinci yang sederhana dan dapat direproduksi dengan melakukan autotransplantasi NP di dekat lempeng ujung vertebra yang dibor. Tujuan lainnya adalah untuk mengamati karakteristik histologis model hewan dan mengevaluasi mekanisme spesifik NP dalam perkembangan MC. Untuk tujuan ini, kami menggunakan teknik seperti biologi molekuler, MRI, dan studi histologis untuk mempelajari perkembangan MC.
Dua kelinci mati karena pendarahan selama operasi, dan empat kelinci mati selama anestesi saat MRI. 48 kelinci yang tersisa selamat dan tidak menunjukkan tanda-tanda perilaku atau neurologis setelah operasi.
MRI menunjukkan bahwa intensitas sinyal jaringan yang tertanam di lubang yang berbeda juga berbeda. Intensitas sinyal badan vertebra L5 pada kelompok NPE secara bertahap berubah pada 12, 16, dan 20 minggu setelah pemasangan (urutan T1W menunjukkan sinyal rendah, dan urutan T2W menunjukkan sinyal campuran ditambah sinyal rendah) (Gambar 1C), sedangkan tampilan MRI dari dua kelompok bagian yang tertanam lainnya tetap relatif stabil selama periode yang sama (Gambar 1A, B).
(A) Gambar MRI berurutan representatif dari tulang belakang lumbal kelinci pada 3 titik waktu. Tidak ditemukan kelainan sinyal pada gambar kelompok operasi semu. (B) Karakteristik sinyal badan vertebra pada kelompok ME mirip dengan kelompok operasi semu, dan tidak ada perubahan sinyal signifikan yang diamati di lokasi penanaman seiring waktu. (C) Pada kelompok NPE, sinyal rendah terlihat jelas pada sekuens T1W, dan sinyal campuran serta sinyal rendah terlihat jelas pada sekuens T2W. Dari periode 12 minggu hingga periode 20 minggu, sinyal tinggi sporadis yang mengelilingi sinyal rendah pada sekuens T2W berkurang.
Hiperplasia tulang yang jelas terlihat pada lokasi implantasi badan vertebra pada kelompok NPE, dan hiperplasia tulang terjadi lebih cepat dari 12 hingga 20 minggu (Gambar 2C) dibandingkan dengan kelompok NPE, tidak ada perubahan signifikan yang diamati pada badan vertebra yang dimodelkan; kelompok Sham dan kelompok ME (Gambar 2C) 2A,B).
(A) Permukaan badan vertebra pada bagian yang diimplan sangat halus, lubang sembuh dengan baik, dan tidak ada hiperplasia pada badan vertebra. (B) Bentuk lokasi implantasi pada kelompok ME mirip dengan kelompok operasi plasebo, dan tidak ada perubahan yang jelas pada penampilan lokasi implantasi seiring waktu. (C) Hiperplasia tulang terjadi pada lokasi implantasi pada kelompok NPE. Hiperplasia tulang meningkat dengan cepat dan bahkan meluas melalui diskus intervertebralis ke badan vertebra kontralateral.
Analisis histologis memberikan informasi yang lebih rinci tentang pembentukan tulang. Gambar 3 menunjukkan foto-foto penampang pascaoperasi yang diwarnai dengan H&E. Pada kelompok operasi sham, kondrosit tersusun dengan baik dan tidak terdeteksi proliferasi sel (Gambar 3A). Situasi pada kelompok ME serupa dengan kelompok operasi sham (Gambar 3B). Namun, pada kelompok NPE, sejumlah besar kondrosit dan proliferasi sel mirip NP diamati di lokasi implantasi (Gambar 3C);
(A) Trabekula terlihat di dekat lempeng ujung, kondrosit tersusun rapi dengan ukuran dan bentuk sel yang seragam dan tidak ada proliferasi (40 kali). (B) Kondisi lokasi implantasi pada kelompok ME mirip dengan kelompok sham. Trabekula dan kondrosit terlihat, tetapi tidak ada proliferasi yang jelas di lokasi implantasi (40 kali). (B) Terlihat bahwa kondrosit dan sel mirip NP berproliferasi secara signifikan, dan bentuk serta ukuran kondrosit tidak seragam (40 kali).
Ekspresi mRNA interleukin 4 (IL-4), mRNA interleukin 17 (IL-17), dan mRNA interferon γ (IFN-γ) diamati pada kelompok NPE dan ME. Ketika tingkat ekspresi gen target dibandingkan, ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ meningkat secara signifikan pada kelompok NPE dibandingkan dengan kelompok ME dan kelompok operasi sham (Gambar 4) (P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok operasi sham, tingkat ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ pada kelompok ME hanya meningkat sedikit dan tidak mencapai perubahan statistik (P > 0,05).
Ekspresi mRNA IL-4, IL-17, dan IFN-γ pada kelompok NPE menunjukkan kecenderungan yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok operasi sham dan kelompok ME (P < 0,05).
Sebaliknya, tingkat ekspresi pada kelompok ME tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (P>0,05).
Analisis Western blot dilakukan menggunakan antibodi yang tersedia secara komersial terhadap IL-4 dan IL-17 untuk mengkonfirmasi pola ekspresi mRNA yang berubah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5A,B, dibandingkan dengan kelompok ME dan kelompok operasi sham, kadar protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok NPE meningkat secara signifikan (P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok operasi sham, kadar protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok ME juga tidak mencapai perubahan yang signifikan secara statistik (P > 0,05).
(A) Kadar protein IL-4 dan IL-17 pada kelompok NPE secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok ME dan kelompok plasebo (P < 0,05). (B) Histogram Western blot.
Karena terbatasnya jumlah sampel manusia yang diperoleh selama pembedahan, studi yang jelas dan rinci tentang patogenesis MC agak sulit dilakukan. Kami mencoba untuk membuat model hewan MC untuk mempelajari mekanisme patologis potensialnya. Pada saat yang sama, evaluasi radiologis, evaluasi histologis, dan evaluasi biologi molekuler digunakan untuk mengikuti perjalanan MC yang diinduksi oleh autograft NP. Hasilnya, model implantasi NP menghasilkan perubahan bertahap dalam intensitas sinyal dari titik waktu 12 minggu hingga 20 minggu (sinyal rendah campuran pada sekuens T1W dan sinyal rendah pada sekuens T2W), yang menunjukkan perubahan jaringan, dan evaluasi histologis serta biologi molekuler mengkonfirmasi hasil studi radiologis.
Hasil percobaan ini menunjukkan bahwa perubahan visual dan histologis terjadi di lokasi infiltrasi badan vertebra pada kelompok NPE. Pada saat yang sama, ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ, serta IL-4, IL-17, dan IFN-γ diamati, menunjukkan bahwa infiltrasi jaringan nukleus pulposus autologus di badan vertebra dapat menyebabkan serangkaian perubahan sinyal dan morfologis. Mudah ditemukan bahwa karakteristik sinyal badan vertebra model hewan (sinyal rendah pada sekuens T1W, sinyal campuran dan sinyal rendah pada sekuens T2W) sangat mirip dengan sel vertebra manusia, dan karakteristik MRI juga mengkonfirmasi pengamatan histologi dan anatomi kasar, yaitu, perubahan pada sel badan vertebra bersifat progresif. Meskipun respons inflamasi yang disebabkan oleh trauma akut dapat muncul segera setelah penusukan, hasil MRI menunjukkan bahwa perubahan sinyal yang meningkat secara progresif muncul 12 minggu setelah penusukan dan bertahan hingga 20 minggu tanpa tanda-tanda pemulihan atau pembalikan perubahan MRI. Hasil ini menunjukkan bahwa NP vertebra autologus adalah metode yang dapat diandalkan untuk membangun MV progresif pada kelinci.
Model tusukan ini membutuhkan keterampilan, waktu, dan upaya bedah yang memadai. Dalam percobaan pendahuluan, diseksi atau stimulasi berlebihan pada struktur ligamen paravertebral dapat mengakibatkan pembentukan osteofit vertebra. Perlu diperhatikan agar tidak merusak atau mengiritasi diskus yang berdekatan. Karena kedalaman penetrasi harus dikontrol untuk mendapatkan hasil yang konsisten dan dapat direproduksi, kami membuat sumbat secara manual dengan memotong selubung jarum sepanjang 3 mm. Penggunaan sumbat ini memastikan kedalaman pengeboran yang seragam di badan vertebra. Dalam percobaan pendahuluan, tiga ahli bedah ortopedi yang terlibat dalam operasi menemukan jarum ukuran 16 gauge lebih mudah digunakan daripada jarum ukuran 18 gauge atau metode lainnya. Untuk menghindari pendarahan berlebihan selama pengeboran, menahan jarum diam untuk sementara waktu akan memberikan lubang insersi yang lebih sesuai, menunjukkan bahwa tingkat MC tertentu dapat dikontrol dengan cara ini.
Meskipun banyak penelitian telah menargetkan MC, sedikit yang diketahui tentang etiologi dan patogenesis MC25,26,27. Berdasarkan penelitian kami sebelumnya, kami menemukan bahwa autoimunitas memainkan peran kunci dalam terjadinya dan perkembangan MC12. Penelitian ini memeriksa ekspresi kuantitatif IL-4, IL-17, dan IFN-γ, yang merupakan jalur diferensiasi utama sel CD4+ setelah stimulasi antigen. Dalam penelitian kami, dibandingkan dengan kelompok negatif, kelompok NPE memiliki ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ yang lebih tinggi, dan kadar protein IL-4 dan IL-17 juga lebih tinggi.
Secara klinis, ekspresi mRNA IL-17 meningkat pada sel NP dari pasien dengan herniasi diskus28. Peningkatan kadar ekspresi IL-4 dan IFN-γ juga ditemukan pada model herniasi diskus non-kompresif akut dibandingkan dengan kontrol sehat29. IL-17 memainkan peran kunci dalam peradangan, cedera jaringan pada penyakit autoimun30 dan meningkatkan respons imun terhadap IFN-γ31. Peningkatan cedera jaringan yang dimediasi IL-17 telah dilaporkan pada tikus MRL/lpr32 dan tikus yang rentan terhadap autoimunitas33. IL-4 dapat menghambat ekspresi sitokin proinflamasi (seperti IL-1β dan TNFα) dan aktivasi makrofag34. Dilaporkan bahwa ekspresi mRNA IL-4 berbeda pada kelompok NPE dibandingkan dengan IL-17 dan IFN-γ pada titik waktu yang sama; Ekspresi mRNA IFN-γ pada kelompok NPE secara signifikan lebih tinggi daripada pada kelompok lain. Oleh karena itu, produksi IFN-γ mungkin merupakan mediator dari respons inflamasi yang diinduksi oleh interkalasi NP. Studi telah menunjukkan bahwa IFN-γ diproduksi oleh berbagai jenis sel, termasuk sel T helper tipe 1 yang teraktivasi, sel natural killer, dan makrofag35,36, dan merupakan sitokin pro-inflamasi utama yang mendorong respons imun37.
Studi ini menunjukkan bahwa respons autoimun mungkin terlibat dalam terjadinya dan perkembangan MC. Luoma dkk. menemukan bahwa karakteristik sinyal MC dan NP yang menonjol serupa pada MRI, dan keduanya menunjukkan sinyal tinggi pada sekuens T2W38. Beberapa sitokin telah dikonfirmasi terkait erat dengan terjadinya MC, seperti IL-139. Ma dkk. menyarankan bahwa penonjolan NP ke atas atau ke bawah mungkin memiliki pengaruh besar pada terjadinya dan perkembangan MC12. Bobechko40 dan Herzbein dkk.41 melaporkan bahwa NP adalah jaringan imunotoleran yang tidak dapat memasuki sirkulasi vaskular sejak lahir. Penonjolan NP memasukkan benda asing ke dalam suplai darah, sehingga memediasi reaksi autoimun lokal42. Reaksi autoimun dapat menginduksi sejumlah besar faktor imun, dan ketika faktor-faktor ini terus menerus terpapar pada jaringan, mereka dapat menyebabkan perubahan dalam pensinyalan43. Dalam penelitian ini, ekspresi berlebihan IL-4, IL-17, dan IFN-γ merupakan faktor imun yang khas, yang semakin membuktikan hubungan erat antara NP dan MCs44. Model hewan ini meniru dengan baik terobosan NP dan masuknya ke lempeng ujung. Proses ini selanjutnya mengungkapkan dampak autoimunitas pada MC.
Seperti yang diharapkan, model hewan ini memberi kita platform yang memungkinkan untuk mempelajari MC. Namun, model ini masih memiliki beberapa keterbatasan: pertama, selama fase pengamatan hewan, beberapa kelinci tahap menengah perlu di-eutanasia untuk pengujian histologis dan biologi molekuler, sehingga beberapa hewan "tidak dapat digunakan" seiring waktu. Kedua, meskipun tiga titik waktu ditetapkan dalam penelitian ini, sayangnya, kami hanya memodelkan satu jenis MC (perubahan Modic tipe I), sehingga tidak cukup untuk mewakili proses perkembangan penyakit manusia, dan lebih banyak titik waktu perlu ditetapkan untuk mengamati semua perubahan sinyal dengan lebih baik. Ketiga, perubahan struktur jaringan memang dapat ditunjukkan dengan jelas melalui pewarnaan histologis, tetapi beberapa teknik khusus dapat lebih baik mengungkapkan perubahan mikrostruktural dalam model ini. Misalnya, mikroskop cahaya terpolarisasi digunakan untuk menganalisis pembentukan fibrokartilago pada diskus intervertebralis kelinci45. Efek jangka panjang NP pada MC dan lempeng ujung membutuhkan penelitian lebih lanjut.
Lima puluh empat kelinci putih New Zealand jantan (berat sekitar 2,5-3 kg, umur 3-3,5 bulan) secara acak dibagi menjadi kelompok operasi palsu, kelompok implantasi otot (kelompok ME), dan kelompok implantasi akar saraf (kelompok NPE). Semua prosedur eksperimental telah disetujui oleh Komite Etika Rumah Sakit Tianjin, dan metode eksperimental dilakukan sesuai dengan pedoman yang telah disetujui.
Beberapa perbaikan telah dilakukan pada teknik bedah S. Sobajima 46. Setiap kelinci ditempatkan dalam posisi berbaring lateral dan permukaan anterior dari lima diskus intervertebralis (IVD) lumbal yang berurutan diekspos menggunakan pendekatan retroperitoneal posterolateral. Setiap kelinci diberi anestesi umum (uretan 20%, 5 ml/kg melalui vena telinga). Sayatan kulit memanjang dibuat dari tepi bawah tulang rusuk ke tepi panggul, 2 cm ventral dari otot paravertebral. Tulang belakang anterolateral kanan dari L1 hingga L6 diekspos dengan diseksi tajam dan tumpul dari jaringan subkutan, jaringan retroperitoneal, dan otot yang menutupi (Gambar 6A). Tingkat diskus ditentukan menggunakan tepi panggul sebagai penanda anatomi untuk tingkat diskus L5-L6. Gunakan jarum tusukan 16-gauge untuk mengebor lubang di dekat lempeng ujung vertebra L5 hingga kedalaman 3 mm (Gambar 6B). Gunakan jarum suntik 5 ml untuk mengaspirasi nukleus pulposus autologus pada diskus intervertebralis L1-L2 (Gambar 6C). Angkat nukleus pulposus atau otot sesuai dengan kebutuhan masing-masing kelompok. Setelah lubang bor diperdalam, jahitan yang dapat diserap ditempatkan pada fasia dalam, fasia superfisial, dan kulit, dengan hati-hati agar tidak merusak jaringan periosteal badan vertebra selama operasi.
(A) Diskus L5–L6 diekspos melalui pendekatan retroperitoneal posterolateral. (B) Gunakan jarum ukuran 16 untuk mengebor lubang di dekat lempeng ujung L5. (C) Folikel autologus diambil.
Anestesi umum diberikan dengan uretan 20% (5 ml/kg) yang diberikan melalui vena telinga, dan rontgen tulang belakang lumbal diulang pada 12, 16, dan 20 minggu pasca operasi.
Kelinci dikorbankan dengan injeksi intramuskular ketamin (25,0 mg/kg) dan natrium pentobarbital intravena (1,2 g/kg) pada 12, 16, dan 20 minggu setelah operasi. Seluruh tulang belakang diangkat untuk analisis histologis dan analisis real dilakukan. Transkripsi balik kuantitatif (RT-qPCR) dan Western blotting digunakan untuk mendeteksi perubahan faktor imun.
Pemeriksaan MRI dilakukan pada kelinci menggunakan magnet klinis 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) yang dilengkapi dengan penerima koil anggota ortogonal. Kelinci dibius dengan uretan 20% (5 mL/kg) melalui vena telinga dan kemudian ditempatkan telentang di dalam magnet dengan daerah lumbal dipusatkan pada koil permukaan melingkar berdiameter 5 inci (GE Medical Systems). Citra lokalisasi koronal berbobot T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) diperoleh untuk menentukan lokasi diskus lumbal dari L3–L4 hingga L5–L6. Irisan bidang sagital berbobot T2 diperoleh dengan pengaturan berikut: urutan spin-echo cepat dengan waktu pengulangan (TR) 2200 ms dan waktu gema (TE) 70 ms, matriks; bidang visual 260 dan delapan stimulus; ketebalan potongan 2 mm, celah 0,2 mm.
Setelah foto terakhir diambil dan kelinci terakhir dibunuh, cakram sham, cakram yang tertanam dalam otot, dan cakram NP dikeluarkan untuk pemeriksaan histologis. Jaringan difiksasi dalam formalin buffer netral 10% selama 1 minggu, didekalsifikasi dengan asam etilenediaminetetraasetat, dan dipotong dengan parafin. Blok jaringan ditanam dalam parafin dan dipotong menjadi potongan sagital (ketebalan 5 μm) menggunakan mikrotom. Potongan diwarnai dengan hematoksilin dan eosin (H&E).
Setelah mengumpulkan cakram intervertebralis dari kelinci di setiap kelompok, total RNA diekstraksi menggunakan kolom UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) sesuai dengan instruksi pabrik dan sistem transkripsi balik ImProm II (Promega Inc., Madison, WI, USA). Transkripsi balik kemudian dilakukan.
RT-qPCR dilakukan menggunakan Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) dan SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) sesuai petunjuk pabrik. Volume reaksi PCR adalah 20 μl dan mengandung 1,5 μl cDNA yang diencerkan dan 0,2 μM masing-masing primer. Primer dirancang oleh OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) dan diproduksi oleh Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) (Tabel 1). Kondisi siklus termal berikut digunakan: langkah aktivasi polimerase awal pada 94°C selama 2 menit, kemudian 40 siklus masing-masing 15 detik pada 94°C untuk denaturasi templat, annealing selama 1 menit pada 60°C, ekstensi, dan pengukuran fluoresensi dilakukan selama 1 menit pada 72°C. Semua sampel diamplifikasi tiga kali dan nilai rata-ratanya digunakan untuk analisis RT-qPCR. Data amplifikasi dianalisis menggunakan FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ dinormalisasi terhadap kontrol endogen (ACTB). Tingkat ekspresi relatif mRNA target dihitung menggunakan metode 2-ΔΔCT.
Total protein diekstraksi dari jaringan menggunakan homogenizer jaringan dalam buffer lisis RIPA (mengandung koktail penghambat protease dan fosfatase) dan kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C untuk menghilangkan sisa-sisa jaringan. Lima puluh mikrogram protein dimuat per lajur, dipisahkan dengan SDS-PAGE 10%, dan kemudian dipindahkan ke membran PVDF. Pemblokiran dilakukan dalam 5% susu bubuk tanpa lemak dalam larutan garam buffer Tris (TBS) yang mengandung 0,1% Tween 20 selama 1 jam pada suhu kamar. Membran diinkubasi dengan antibodi primer kelinci anti-dekorin (diencerkan 1:200; Boster, Wuhan, Cina) (diencerkan 1:200; Bioss, Beijing, Cina) semalaman pada suhu 4°C dan direaksikan pada hari kedua; dengan antibodi sekunder (imunoglobulin G anti-kelinci kambing pada pengenceran 1:40.000) dikombinasikan dengan peroksidase lobak (Boster, Wuhan, Cina) selama 1 jam pada suhu kamar. Sinyal Western blot dideteksi oleh peningkatan kemiluminesensi pada membran kemiluminesen setelah penyinaran sinar-X. Untuk analisis densitometri, blot dipindai dan dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak BandScan dan hasilnya dinyatakan sebagai rasio imunoreaktivitas gen target terhadap imunoreaktivitas tubulin.
Perhitungan statistik dilakukan menggunakan paket perangkat lunak SPSS 16.0 (SPSS, AS). Data yang dikumpulkan selama penelitian dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (mean ± SD) dan dianalisis menggunakan analisis varians (ANOVA) satu arah berulang untuk menentukan perbedaan antara kedua kelompok. P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Dengan demikian, pembentukan model hewan MC dengan menanamkan NP autologus ke dalam badan vertebra dan melakukan pengamatan makroanatomi, analisis MRI, evaluasi histologis, dan analisis biologi molekuler dapat menjadi alat penting untuk menilai dan memahami mekanisme MC pada manusia serta mengembangkan intervensi terapeutik baru.
Cara mengutip artikel ini: Han, C. dkk. Model hewan perubahan Modic dibuat dengan menanamkan nukleus pulposus autologus ke dalam tulang subkondral tulang belakang lumbal. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., dan Boos, N. Pencitraan resonansi magnetik tulang belakang lumbal: prevalensi herniasi dan retensi diskus, kompresi akar saraf, kelainan lempeng ujung, dan osteoartritis sendi faset pada sukarelawan tanpa gejala. Radiologi 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, dan Leboeuf-Eed, K. Perubahan Modic dan hubungannya dengan temuan klinis. European Spine Journal: publikasi resmi European Spine Society, European Society of Spinal Deformity, dan European Society for Cervical Spine Research 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., dkk. Perubahan Modic pada lempeng ujung vertebra lumbal: prevalensi dan kaitannya dengan nyeri punggung bawah dan linu panggul pada pekerja pria usia menengah. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., dan Dalinka, M. MRI perubahan sumsum tulang di dekat lempeng ujung pada penyakit degeneratif tulang belakang lumbal. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, dan Carter, JR. Penyakit degeneratif diskus: evaluasi perubahan sumsum tulang belakang dengan MRI. Radiologi 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, dan Carter, JR. Pencitraan penyakit degeneratif diskus. Radiologi 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, dkk. Prediktor perubahan sinyal lempeng ujung neovertebral (Modic) pada populasi umum. European Spine Journal: Publikasi Resmi European Spine Society, European Society of Spinal Deformity, dan European Society for Cervical Spine Research, Divisi 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB dan Mannisch, K. Perubahan Modic setelah herniasi diskus lumbal. European Spine Journal: Publikasi Resmi European Spine Society, European Society of Spinal Deformity dan European Society for Cervical Spine Research 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., dan Kaapa, E. Perubahan tipe Modic I dapat memprediksi degenerasi diskus deformasional yang berkembang pesat: studi prospektif 1 tahun. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ dan Fan, SW Perubahan Modic: kemungkinan penyebab dan kontribusi terhadap degenerasi diskus lumbal. Hipotesis Medis 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV. Ruptur diskus internal. Masalah prolaps diskus selama lebih dari 50 tahun. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Waktu posting: 13 Desember 2024